Detección de ARN sin amplificación en un solo paso mediante el emparejamiento de CRISPR-Cas13a con una...

Sus antecedentes:

• La detección de ARN es crucial para el diagnóstico de patógenos, pero los métodos actuales como la RT-qPCR requieren equipos complejos, lo que limita las aplicaciones en el punto de atención (POC).
• La amplificación isotérmica ofrece alternativas más sencillas pero enfrenta desafíos con la contaminación y la eficiencia.
• Las herramientas de diagnóstico de ARN existentes a menudo no son adecuadas para entornos con recursos limitados o in situ.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una plataforma novedosa, isotérmica y de un solo paso para la detección de ARN para el diagnóstico rápido y sensible de patógenos.
• Superar las limitaciones de los ensayos basados en ARN existentes, incluida la necesidad de transcripción inversa e instrumentación compleja.
• Crear una plataforma de biosensores versátil y programable adecuada para diversos agentes infecciosos y adaptable a diferentes formatos de lectura.

Principales métodos:

• Se desarrolló RAPID (CRISPR-Cas13a con una desoxirribozima impulsada por un circuito de amplificación en cascada), una plataforma de biosensores isotérmica.
• Se integró CRISPR-Cas13a para el reconocimiento del objetivo con un circuito de ADN para la amplificación de la señal, eliminando la necesidad de transcripción inversa y ciclado térmico.
• Se permitió la detección cuantitativa de ARN en 30 minutos a 37 °C, compatible con lecturas de fluorescencia (RAPID-Flu) y ensayos de flujo lateral (RAPID-LFA).

Principales resultados:

• RAPID logró la detección cuantitativa de ARN en 30 minutos a 37 °C sin preamplificación de la muestra.
• La plataforma detectó con éxito objetivos bacterianos (Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae) y virales (virus del herpes simple) reprogramando las crARN.
• Tanto RAPID-Flu como RAPID-LFA demostraron una sensibilidad de 5 fM por reacción, límites de detección comparables, excelente especificidad y alta concordancia con los diagnósticos clínicos.

Conclusiones:

• La plataforma RAPID ofrece una solución rápida, programable y visualmente interpretable para diagnósticos de ARN en el punto de atención.
• Su flexibilidad, portabilidad y naturaleza isotérmica la hacen ideal para el diagnóstico temprano y el monitoreo in situ de patógenos infecciosos.
• RAPID presenta un avance significativo para los diagnósticos basados en ácidos nucleicos en diversos entornos, abordando las limitaciones actuales en velocidad, complejidad y accesibilidad.