La ingeniería guiada por la estructura de KshA produce una 9α-hidroxilasa de alto rendimiento para la síntesis de...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología La biotecnología es la biotecnología.
• Ingeniería de enzimas Ingeniería de enzimas Ingeniería de enzimas
• Química de los esteroides Química de los esteroides

Sus antecedentes:

• El 9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona (9α-OH-AD) es un intermediario farmacéutico clave.
• La producción industrial actual de 9α-OH-AD está limitada por la estabilidad y actividad de la 9α-hidroxilasa (KSH).

Objetivo del estudio:

• Diseñar una variante de 9α-hidroxilasa (KSH) de alto rendimiento para una mayor producción industrial de 9α-OH-AD.
• Identificar los principales cuellos de botella en la actividad y la estabilidad de KSH.

Principales métodos:

• Se empleó la mutagénesis guiada por la estructura para identificar puntos calientes de mutación en la subunidad KshA.
• Se creó y caracterizó una triple mutante KshA^{L263A/G321N/D325 de grado extra K.}
• Se utilizaron simulaciones moleculares para evaluar la estabilidad estructural y la accesibilidad del sustrato.
• Se construyó una cepa *Escherichia coli* diseñada que coexpresaba las subunidades KSH de la variante.

Principales resultados:

• El triple mutante KshA^{L263A/G321N/D325 grado K exhibió un aumento de 10,3 veces en la actividad y una mejora de 5,04 veces en *k*_cat/*K*_m en comparación con el KSH de tipo salvaje.}
• Las simulaciones moleculares confirmaron una mayor estabilidad estructural y accesibilidad al sustrato para el mutante.
• La cepa de *E. coli* modificada logró una alta concentración de 119.8 mM 9α-OH-AD de 4-AD en la fermentación de lotes alimentados.

Conclusiones:

• La variante KSH de ingeniería representa una mejora significativa para la producción industrial de 9α-OH-AD.
• Este trabajo proporciona una enzima de alto rendimiento para la síntesis eficiente y escalable de intermediarios farmacéuticos esteroideos.