Permutación circular de ingeniería mejora la eficiencia de amplificación de la polimerasa Bst DNA

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular
• Biotecnología
• Ensayos de Diagnóstico

Sus antecedentes:

• La ADN polimerasa Bst quimérica (HpStBL) mostró ser prometedora para la detección de ácidos nucleicos, pero enfrentó limitaciones.
• El diseño complejo de cebadores y la amplificación inespecífica obstaculizaron una aplicación más amplia de HpStBL en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).

Objetivo del estudio:

• Desarrollar polimerasas de ADN mejoradas para la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la LAMP de transcripción inversa (RT-LAMP).
• Crear un método de detección de ácidos nucleicos simplificado y rápido con un rendimiento mejorado.

Principales métodos:

• Se generaron cuatro mutantes de ADN polimerasa Bst de permutación circular (CP) alterando el dominio Hp47-Sto7d de HpStBL.
• Se evaluó la síntesis de ADN y la actividad de transcriptasa inversa de los mutantes.
• Se desarrolló un sistema de detección de ácidos nucleicos utilizando el mutante CP-G23 y la recombinasa de Thermus thermophilus.

Principales resultados:

• La permutación circular alteró la hidrofobicidad y la afinidad por el ADN de la proteína, produciendo mutantes con síntesis de ADN y actividad de transcriptasa inversa.
• El mutante CP-G23 exhibió un rendimiento de amplificación superior, detectando tan solo 10⁰ copias/μL de ADN de Astrovirus.
• El sistema basado en CP-G23 amplificó con éxito ADN de Astrovirus y ARN de SARS-CoV-2 en 45 minutos utilizando un solo par de cebadores, sin necesidad de transcriptasa inversa.

Conclusiones:

• La permutación circular es una estrategia eficaz para mejorar el rendimiento de las ADN polimerasas en ensayos LAMP.
• La novedosa polimerasa CP-G23 y el método de detección asociado ofrecen un enfoque simplificado, rápido y sensible para la detección de ADN/ARN.
• Este método tiene un potencial significativo para el diagnóstico clínico y las pruebas moleculares.