Base estructural para la adquisición de espaciadores dirigida por Cas9 en sistemas CRISPR-Cas de tipo II-A

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular
• Microbiología
• Biología Estructural

Sus antecedentes:

• Los sistemas CRISPR-Cas proporcionan a los procariotas inmunidad adaptativa contra elementos genéticos extraños.
• Los sistemas CRISPR-Cas de tipo II-A, que incluyen Cas9, Csn2 y Cas1-Cas2, son cruciales para la integración de fragmentos de ADN extraños (preespaciadores) en el genoma del huésped.
• Los mecanismos estructurales que subyacen a la adquisición de espaciadores en los sistemas de tipo II-A eran previamente desconocidos.

Objetivo del estudio:

• Elucidar la base estructural de la adquisición de espaciadores en el sistema CRISPR-Cas de tipo II-A de Enterococcus faecalis.
• Comprender las funciones de Cas9, Csn2 y Cas1-Cas2 en el reconocimiento de motivos adyacentes al protospaciador (PAM) y preespaciadores.
• Revelar el mecanismo de integración direccional de preespaciadores en el array CRISPR.

Principales métodos:

• Se utilizó la crio-microscopía electrónica (cryo-EM) para determinar las estructuras del supercomplejo Enterococcus faecalis Cas9-Csn2-Cas1-Cas2.
• Se resolvieron estructuras tanto para el estado apo (en reposo) como para un estado unido a ADN (captura de preespaciadores).
• El análisis estructural se centró en las interacciones proteína-ADN y los cambios conformacionales durante el proceso de adaptación.

Principales resultados:

• El estado apo reveló un supercomplejo en reposo (Cas9₂-Csn2₈-Cas1₈-Cas2₄).
• La unión del ADN indujo un complejo de captura de preespaciadores donde el ADN se enhebra a través de Csn2, lo que permite a Cas9 buscar la secuencia PAM.
• Cas9 y Csn2 juntos definen un segmento de ADN de 30 pb, y la disociación de Cas9 expone el ADN para la unión e integración de Cas1-Cas2.

Conclusiones:

• El estudio revela el mecanismo acoplado de reconocimiento de PAM y selección de preespaciadores por Cas9, Csn2 y Cas1-Cas2.
• Las ideas estructurales explican cómo el sistema de tipo II-A garantiza la fidelidad durante la integración del ADN extraño.
• Este trabajo proporciona una comprensión mecanicista del paso de adaptación en la inmunidad procariota mediada por CRISPR.