Blot colorimétrico CoFi basado en actividad rápida para el cribado de oxidorreductazas dependientes de FAD diseñadas...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Biología Molecular Biología Molecular
• Ingeniería de proteínas Ingeniería de proteínas.

Sus antecedentes:

• La detección de alto rendimiento de las bibliotecas de variantes de proteínas es crucial para el avance de la biotecnología.
• La validación funcional de la actividad enzimática sigue siendo un cuello de botella en los flujos de trabajo de ingeniería de proteínas.
• Los métodos existentes a menudo carecen de eficiencia o no pueden medir directamente el rendimiento enzimático.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método rápido y sin etiquetas para evaluar la actividad enzimática y la solubilidad.
• Para cerrar la brecha entre el diseño computacional de proteínas y la validación funcional experimental.
• Proporcionar una herramienta rentable para la selección de bibliotecas de enzimas de ingeniería.

Principales métodos:

• Desarrolló un ensayo colorimétrico de filtración de colonias (CoFi).
• Se utilizó una reacción de acoplamiento redox basada en 2,6-diclorfenolindofenol (DCIP) para la visualización.
• Aplicó el método a la glucosa deshidrogenasa dependiente de FAD (FAD-GDH) en las colonias de E. coli.
• Solubilidad enzimática y actividad catalítica evaluadas simultáneamente.

Principales resultados:

• El CoFi blot visualiza la rotación enzimática directamente en una membrana en cuestión de minutos.
• Se identificaron con éxito variantes de FAD-GDH de alta actividad de bibliotecas diseñadas.
• La variante de plomo mostró un aumento de 16 veces en el área de halo de decoloración en comparación con el tipo salvaje.
• Evaluación simultánea demostrada de la solubilidad y la actividad.

Conclusiones:

• El CoFi blot es un método ultrarrápido, libre de etiquetas y basado en la actividad para la validación funcional de enzimas.
• Este enfoque acelera significativamente el cribado de las variantes de proteínas.
• La plataforma es aplicable a una amplia gama de oxidorreductasas que reducen el DCIP.