Técnica de cribado de afinidad FRET de alto rendimiento (HTFAST) para la caracterización de proteínas de unión...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Ingeniería de Proteínas
• Biofísica

Sus antecedentes:

• La síntesis de proteínas sin células (CFPS) permite la ingeniería rápida de proteínas de unión de alta afinidad.
• La caracterización de alto rendimiento de la afinidad de unión es un cuello de botella, especialmente para proteínas no purificadas de CFPS.
• El aprendizaje automático guía la optimización, lo que requiere una validación de unión eficiente.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método cuantitativo de alto rendimiento para el cribado de afinidad de proteínas de unión expresadas sin células.
• Permitir la caracterización rápida de proteínas de unión directamente en lisados crudos sin purificación.
• Acelerar el desarrollo de proteínas de unión de próxima generación a través de un cribado optimizado.

Principales métodos:

• Desarrollo de la Técnica de Cribado de Afinidad FRET de Alto Rendimiento (HTFAST) utilizando la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET).
• Utilización de aglutinantes fusionados con proteína fluorescente y antígenos marcados con tinte para la medición del equilibrio de la constante de disociación en tiempo real.
• Optimización de pares de fluoróforos y parámetros de etiquetado utilizando el sistema SpyTag003-SpyCatcher003.

Principales resultados:

• HTFAST cuantificó de manera confiable afinidades de unión nanomolares en lisados crudos.
• Validamos la plataforma para nanobodies, incluido un nanobody que se une a CD4 (Nb457).
• Benchmarking exitoso de sdAbs del dominio de unión al receptor de SARS-CoV-2, clasificando sus fortalezas de unión.
• Demostramos que ambos socios de unión pueden expresarse directamente en CFPS.

Conclusiones:

• HTFAST ofrece un enfoque escalable, cuantitativo y compatible con sistemas sin células para el cribado de afinidad de alto rendimiento.
• El método es muy adecuado para campañas de Diseño-Construcción-Prueba-Aprendizaje (DBTL).
• Acelera el desarrollo de proteínas de unión de alta afinidad para diversas aplicaciones.