Ensayo de reportero en paralelo masivo para mapear regiones reguladoras específicas de genes con resolución de un...

Área de la Ciencia:

• Genómica
• Biología del desarrollo
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La regulación génica precisa es crucial para el desarrollo y la función de los tejidos.
• El mapeo de módulos cis-regulatorios (CRM) con alta resolución y en tipos celulares específicos es un desafío importante en genómica.

Objetivo del estudio:

• Presentar y validar dos estrategias novedosas y complementarias basadas en MPRA (LS-MPRA y d-MPRA) para el descubrimiento de CRM de alta resolución.
• Superar las limitaciones en rendimiento, resolución y requisitos de conocimiento previo para el mapeo de CRM.

Principales métodos:

• El MPRA específico de locus (LS-MPRA) utiliza bibliotecas basadas en BAC para un muestreo denso de regiones genómicas y una interrogación de actividad de CRM sin sesgos.
• El MPRA degenerado (d-MPRA) emplea mutagénesis sistemática para la resolución de un solo nucleótido de la arquitectura del CRM y la identificación de bases reguladoras esenciales.
• Aplicación a genes de la retina de ratón en bastones y interneuronas bipolares, y retina y médula espinal de pollo, demostrando utilidad entre especies y entre tejidos.

Principales resultados:

• LS-MPRA identificó con éxito CRM conocidos y novedosos, incluidos aquellos asociados con genes vecinos.
• El análisis LS-MPRA y d-MPRA del gen Olig2 en progenitores de la retina identificó regiones reguladoras, diseccionadas además mediante análisis de motivos.
• Los ensayos CUT&RUN confirmaron la unión directa de factores de transcripción a elementos candidatos.
• Se demostró la aplicabilidad en modelos de ratón y pollo, destacando el potencial entre especies y entre tejidos.

Conclusiones:

• LS-MPRA y d-MPRA ofrecen una plataforma rápida, escalable, económica y accesible para el descubrimiento de CRM sin sesgos.
• Estos métodos permiten la identificación de CRM sin anotación previa de elementos y con tamaños de fragmento ajustables.
• La plataforma desarrollada avanza significativamente la capacidad de mapear elementos reguladores de genes en diversos contextos biológicos.