Sistema CRISPR/Cas12a diseñado con crRNA acoplado a RPA para la detección ultrasensible de Lactiplantibacillus...

Área de la Ciencia:

• Microbiología
• Biología Molecular
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• El creciente mercado de probióticos requiere métodos avanzados para la identificación precisa de cepas bacterianas.
• Las técnicas de detección actuales pueden consumir mucho tiempo y carecer de la sensibilidad requerida para un control de calidad robusto.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una plataforma de fluorescencia rápida, sensible y precisa en un solo paso para la detección de Lactiplantibacillus plantarum.
• Diseñar un sistema CRISPR/Cas12a para mejorar el rendimiento diagnóstico.

Principales métodos:

• Integración de la Amplificación por Polimerasa de Recombinasa (RPA) con un sistema CRISPR/Cas12a mejorado (RPA-ECas12a).
• Extensión del extremo 5' del ARN CRISPR (crRNA) de forma racional para optimizar la actividad de trans-escisión de Cas12a, identificando una variante óptima (5'crRNA10).
• Aplicación de la plataforma a matrices alimentarias complejas, incluyendo polvos probióticos y yogures.

Principales resultados:

• La variante 5'crRNA10 optimizada mejoró la eficiencia catalítica de Cas12a en un 33% en comparación con el crRNA de tipo salvaje.
• La plataforma RPA-ECas12a logró un límite de detección de 1,3 UFC/mL para L. plantarum.
• La detección se completó en 45 minutos con alta precisión (CVs < 10%) y selectividad en diversas muestras de alimentos.

Conclusiones:

• La plataforma RPA-ECas12a desarrollada proporciona una herramienta sensible, rápida y robusta para la autenticación de probióticos.
• La estrategia de ingeniería de crRNA es generalizable para mejorar el rendimiento de CRISPR/Cas12a en aplicaciones de diagnóstico.
• Este método apoya el control de calidad y la seguridad en la creciente industria de probióticos.