配列特異的なダイヌクレオチド分裂は,DNAの隣接する改変核酸間のシナギスティック相互作用によって促進されます

Jia Liu Wolfe¹, Bing H Wang, Tomohiko Kawate

¹Nuvelo, Inc., 60 Hampshire Street, Cambridge, MA 02139, USA. wolfe@molbio.mgh.harvard.edu

Journal of the American Chemical Society

|August 28, 2003

まとめ

研究者は,改変された核酸を用いて,ダイヌクレオチド配列の特定の割れ目のためにDNAを設計した. この新しい方法は,分子生物学アプリケーションの自然制限酵素を超えて,DNA操作ツールを拡張します.

科学分野:

分子生物学は分子生物学である.
バイオケミストリーバイオケミストリー
合成生物学合成生物学とは

背景:

制限内核酵素はDNA操作に不可欠ですが,特異性は限られています.
制限酵素の多様性を拡大するためのタンパク質工学の努力は,限られた成功を収めました.
配列特異のDNA分裂を達成するための新しい方法が必要である.

研究の目的:

定義されたダイヌクレオチド部位で特定の分裂に敏感なDNA配列を生成するための新しい方法論を開発する.
人工分裂特異性を生み出すことにより,天然の制限酵素の限界を克服する.
断片的なDNA断片を生成するためのこの方法の有用性を実証するために.

主な方法:

DNAポリメラーゼによる2つのデオキシリボヌクレオチドアナログ (リボヌクレオチドと5'-アミノ-2',5'-デオキシリボヌクレオチド) の組み込み.
5'から3'の結合を用いて,改変した核酸がリン酸ミダート結合の割れ目を促進する.
実験的検証のために,この方法をトランスファーリン受容体遺伝子に適用する.

主要な成果:

ディヌクレオチドの特定の分裂部位を持つ改変DNA配列の成功生成.
2つの組み込まれたアナログのシナガティックな作用によって媒介されるシーケンス固有の分裂の実証.
ゲルエレクトロフォレスと質量スペクトロメトリーで可視化されたトランスファーリン受容体遺伝子からの離散DNA断片の生成.

結論:

開発された方法論は,配列特異的な分裂のためにDNAを設計するための新しいアプローチを提供します.
この方法は,DNA操作のためのツールキットを拡張し,自然な制限酵素よりも大きな柔軟性を提供します.
特定のDNA断片を生成する能力は,様々な分子生物学アプリケーションに意味を持っています.

さらに関連する動画

07:04

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Published on: February 5, 2019

06:24

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Published on: February 13, 2019

関連する概念動画

02:04

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages...

02:31

Homologous Recombination

The basic reaction of homologous recombination (HR) involves two chromatids that contain DNA sequences sharing a significant stretch of identity. One of these sequences uses a strand from another as a template to synthesize DNA in an enzyme-catalyzed reaction. The final product is a novel amalgamation of the two substrates. To ensure an accurate recombination of sequences, HR is restricted to the S and G2 phases of the cell cycle. At these stages, the DNA has been replicated already and the...

02:08

Gene Conversion

Other than maintaining genome stability via DNA repair, homologous recombination plays an important role in diversifying the genome. In fact, the recombination of sequences forms the molecular basis of genomic evolution. Random and non-random permutations of genomic sequences create a library of new amalgamated sequences. These newly formed genomes can determine the fitness and survival of cells. In bacteria, homologous and non-homologous types of recombination lead to the evolution of new...

02:53

Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

Because the DNA segments are cut and reorganized in a direction-specific manner, site-specific recombination has emerged as an efficient genetic engineering technique. Flippase and Cyclization recombinases or Flp and Cre, respectively, are two members of the tyrosine recombinase family derived from bacteriophages, that are used to mediate site-specific DNA insertions, deletions, and targeted expression of proteins in mammalian cell lines.
The recognition sites for Cre recombinase called LoxP...