ナノ秒の時間解像度を持つ光検出を用いたチロシンリン酸化のための単一ラベルキナーゼとフォスファタゼアッセイ
Harekrushna Sahoo1, Andreas Hennig, Mara Florea
1School of Engineering and Science, Jacobs University Bremen, Campus Ring 1, D-28759 Bremen, Germany.
Journal of the American Chemical Society
|November 30, 2007
まとめ
2,3-diazabicyclo[2.2.2]oct-2-ene (Dbo) の光抑制を用いた新しい測定法で,チロシンキナーゼとフォスファターゼの活性が測定されています. この方法は,酵素活性モニタリングと阻害剤スクリーニングに高い感度と広範な適用性を提供します.
科学分野:
- バイオケミストリー バイオケミストリー
- 酵素の動力学について
- 光スペクトロスコピーは,光スペクトロスコピーを用います.
背景:
- タイロシンキナーゼとフォスファタゼは,細胞信号伝達の重要な調節因子です.
- これらの酵素に対する既存の測定は,感度と範囲の制限があります.
- 強力な酵素活性評価のために,単一のラベリング戦略が必要である.
研究 の 目的:
- タイロシンキナーゼとフォスファタゼの活性に対する新しい光消火試験を導入し,検証する.
- このアッセイが様々な酵素と基板の組み合わせで広く適用可能であることを実証する.
- 抑制剤スクリーニングにおけるこの試験の可能性を調査する.
主な方法:
- ペプチド基板に2,3-ディアザビサイクロ[2.2.2]オクト-2-エネ (Dbo) を含んだアスパラジン残留物のラベリング.
- 水素原子抽象化による衝突誘発の光消火の監視.
- ステイシーステートおよびナノ秒時間解像度フローレセント (Nano-TRF) 検出の両方を利用します.
主要な成果:
- Dboラベルのアッセイは,酵素反応中に有意な光変化 (最大7倍) を示した.
- このアッセイは,Srcキナーゼ,EGFRキナーゼ,およびさまざまなフォスファタゼを含む12の基板-酵素組合せで広範な適用性を示しました.
- ナノ秒時間解像度の光 (Nano-TRF) は,感度と背景の差別を高めました.
- モリブダートは,このアッセイを使用して,酸性およびアルカリ性ファスファタゼの阻害剤として識別されました.
結論:
- Dbo光 quenching assayは,チロシンキナーゼとフォスファタゼの活性度を測定するための敏感で汎用的なツールです.
- Nano-TRF検出を使用するアッセイの能力は,パフォーマンスを向上させ,その有用性を拡張します.
- この方法は,酵素阻害剤の高通量スクリーニングに重要な可能性を秘めています.
