多色フローサイトメトリを用いて設計されたチロシンの異なった翻訳後の形態を区別できるプロテアゼ

科学分野:

• バイオケミストリー バイオケミストリー
• 酵素工学とは
• プロテオミクス プロテオミクスは,プロテオミクスの

背景:

• Escherichia coli endopeptidase OmpTは,細菌の外膜に含まれる重要な酵素である.
• タイロシン残基の翻訳後の改変により,ペプチドの特性が大幅に変化します.
• 改変されたアミノ酸を特定認識する酵素の開発は,高度なタンパク質研究にとって極めて重要です.

研究 の 目的:

• 3-ニトロチロシンを含むペプチドに対する高特異性を持つE. coliエンドペプチダゼOmpTの変種を分離し,特徴づけること.
• 精密調整された基板特異性を持つ酵素を識別するための高通量スクリーニング方法を開発し,実装する.
• プロテアゼの作成のための基礎を確立し,プロテオミクスのアプリケーションで3-ニトロチロジン認識のために特別に設計された.

主な方法:

• E. coli endopeptidase OmpT.の大型ミュータントライブラリの構築とスクリーニング
• 酵素スクリーニングのための多色フローサイトメトリックアッセイの実施.
• 選択と対選択の光基板の同時使用により,望ましい特異性を持つ希少な酵素変種を隔離します.

主要な成果:

• 高活性なOmpT変異種を k ((cat) / K ((M) 約10 ((5) M ((-1) s ((-1)) で分離した.
• 3-ニトロチロシン後のペプチドの選択的水解が実証されています.
• 変更されていないチロシン (160倍),スルフォチロシン (3600倍),フォスフォチロシン (>8000倍),およびフォスフォセリン (>8000倍) に対して有意な差別化を達成しました.

結論:

• 精巧な選択性を持つ酵素は,高度な高通量スクリーニングを使用して,大規模なライブラリから分離することができます.
• 開発された多色フローサイトメトリーアッセイは,微調整された基板特異性を持つ酵素変種を隔離するのに有効です.
• この研究は,プロテオミクスの応用のために,3-ニトロチロシン特異のプロテアゼを生産するための重要な進歩を表しています.