実験室内選択のためのDNAの化学を拡張する
Jonathan D Vaught1, Chris Bock, Jeff Carter
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309-0215, USA.
Journal of the American Chemical Society
|March 6, 2010
まとめ
修正されたデオキシヌクレオチド三酸塩 (dUTP) 誘導体は,難しいタンパク質標的に対するDNAアプタマー選択を成功させる. これらの改変されたdUTPは,TNFRSF9.9のインビトロ選択における以前の制限を克服し,高親和性アプタマー分離を容易にする.
科学分野:
- バイオケミストリー バイオケミストリー
- 分子生物学は分子生物学である.
- 合成化学 合成化学とは
背景:
- 実験室内選択は,DNAアプタマーを発見するための強力な方法である.
- TNFRSF9のような特定のタンパク質標的は,標準的なデオキシヌクレオチドを使用した伝統的なインビトロ選択方法に耐火性があります.
- モディファイドデオキシヌクレオチドトリホスファート (dUTP) 誘導体は,そのような制限を克服する可能性を秘めています.
研究 の 目的:
- 試験管内選択のための新しい5位変形dUTP誘導体を合成し,評価する.
- これらの改変されたdUTPsと,PCRとプライマー拡張を含む酵素DNA合成の互換性を評価する.
- 改変されたdUTPが,以前に難解な標的であるTNFRSF9.9に対してDNAアプタマーの選択を可能にできるかどうかを判断する.
主な方法:
- アミド結合を特徴とする6種類の新しい5位変形dUTP誘導体の合成.
- 商用DNAポリメラーゼ6種がPCRおよびプライマー延長反応中にこれらの改変されたdUTPを組み込む能力をテストする.
- TNFRSF9に対する改変DNAライブラリを使用してin vitro選択実験を行い,結果を標準デオキシヌクレオチドトリホスファート (TTP) と比較した.
主要な成果:
- 改変されたdUTPは標準PCR条件と互換性はありませんでしたが,プライマー拡張反応では成功裏に組み込まれました.
- KOD XLおよびD. Vent DNAポリメラーゼは,改変されたdUTPsを持つ全長プライマー拡張製品を合成する高効率性を示しました.
- 改変DNAライブラリを用いたインビトロ選択により,TNFRSF9に対する最初の高親和性DNAアプタマーが得られました.
結論:
- 新規の5位変形dUTP誘導体は,プライマー拡張反応で効果的に利用できます.
- これらの改変されたdUTPは,TNFRSF9.9のような困難なタンパク質標的に対するDNAアプタマーのインビトロ選択を成功させる.
- 開発された改変されたdUTPは,以前は難解な標的に対するアプタマー発見の重要な進歩を表しています.
関連する概念動画
01:24DNA Isolation
DNA isolation protocols can be fast and straightforward or complex and time-consuming depending on the type and quality of DNA required for further processing. For example, plasmid DNA extraction is a bit more complicated than genomic DNA extraction because of the need for an appropriate lysis method to separate plasmid DNA from gDNA during isolation. However, for specific applications, such as long-range DNA sequencing that require a good yield of high- quality DNA samples, we need to follow...
00:57Antibiotic Selection
Overview
01:16In vitro Mutagenesis
To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.
01:20The Central Dogma
The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between DNA and Proteins
In the early 1900s, scientists discovered that DNA stores all the information needed for cellular functions and that proteins perform most of these functions. However, the mechanisms of converting genetic information into functional proteins remained unknown for many years. Initially, it was believed that a single gene is...
RNA is the Missing Link Between DNA and Proteins
In the early 1900s, scientists discovered that DNA stores all the information needed for cellular functions and that proteins perform most of these functions. However, the mechanisms of converting genetic information into functional proteins remained unknown for many years. Initially, it was believed that a single gene is...