光素は,酵素媒介によるアジド結合とストレイン誘発型サイクル添加を経由して細胞タンパク質を標的にする

科学分野:

• バイオケミストリー バイオケミストリー
• 分子生物学は分子生物学である.
• 化学生物学 化学生物学とは

背景:

• 小分子フッ素光は,細胞イメージングのための光タンパク質に比べて,より小さなサイズ,より高い明るさ,より優れた光安定性などの利点を提供しています.
• 以前の研究で,リポ酸リガゼ (LplA) 変異体とペプチドタグ (LAP) を使用したタンパク質を青色フッ素ホルモンの標的とする方法が確立されました.

研究 の 目的:

• LplAベースの酵素ラベリングを緑色および赤色フッ素光体に拡張する.
• 多様な細胞タンパク質のイメージングのための最適化された2段階のラベリング戦略を開発する.

主な方法:

• LAPタグへのアジド群のサイト固有の酵素結合を伴う2段階のアプローチで,それに続いて,サイクロオクチネ-フッ素ホルモンの結合体による銅フリークリック化学が行われます.
• 効率的なフローロフォール結合のために,aza-dibenzocyclooctyne (ADIBO) やmonofluorinated cyclooctyne (MOFO) を含むさまざまなサイクロオクチン誘導体の評価.
• LAP融合タンパク質をタグ付けるために,さまざまな哺乳類の細胞系に最適化されたラベル付けスキームを適用する.

主要な成果:

• LplAのW37I変異体は,10-アジドデカノ酸を細胞内のLAPタグに効率的に結合させた.
• ADIBO-fluorophoresは高特異性を提供し,MOFO-fluorophoresはATTO 647N.のような水嫌性染料に対して優れていた.
• 光素,ロダミン,Alexa Fluor 568,ATTO 647N,ATTO 655.5 を含む幅広いフローロフォアを使用して,LAP融合タンパク質の画像撮影に成功しました.

結論:

• 最適化された2段階の酵素および化学的ラベリング戦略により,哺乳類の細胞における汎用的かつ効率的なサイト固有のタンパク質ラベリングが可能になります.
• この方法は,小分子フッ素光子の幅広いスペクトルの使用を可能にし,細胞画像処理能力を大幅に向上させます.