ミトコンドリアのチオレドキシンに反応するオフオン光探査機. | JoVE Visualize

科学分野:

バイオケミストリーバイオケミストリー
細胞生物学細胞生物学
化学生物学化学生物学とは

背景:

ミトコンドリアのチオレドキシン (Trx) は,細胞のリドックスホメオスタシスにおいて重要な役割を果たします.
Trx活動の正確な視覚化と定量化は,その生物学的機能を理解するために不可欠です.
Trx活性を検出するための既存の方法は,感度と特異性において制限があります.

研究の目的:

ミトコンドリアのTrx活動を視覚化するための新しい光センサーであるMito-Naphを合成し,特徴づけること.
ミトナフをTrx in vitroおよびin vivoを検出するための敏感で選択的なツールとして確立する.
Trx.とのミトナフの反応の運動学と特異性を調査する.

主な方法:

ミト・ナフの光探査機の合成.
フローロメトリックアッセイは,Trx活動と探査機運動を測定するものです.
生きている細胞におけるミトコンドリアのTrx活動を視覚化するためのコンフォカル顕微鏡.
Trx阻害剤であるPX-12を用いた抑制研究.
Trxを枯渇させ,探査機の反応を評価するために免疫プレシピテーション.

主要な成果:

Mito-Naphは,Trx.によるディスルファイド割れに際して"オフオン"の光反応を示しています.
探査機は,ナノモラー濃度 (50 nMまで) でTrx活動を検出します.
Mito-Naphは,他の生物学的チオールよりもTrxに高い特異性を示し,GSHよりも約5000倍速い反応率を示しています.
阻害および枯渇の研究は,生細胞および細胞抽出物におけるTrxとの探査機の選択的反応を確認しています.

結論:

Mito-Naphは,ミトコンドリアのTrx活動を視覚化および定量化するための非常に敏感で選択的な光センサーです.
探査機の特性により,細胞の酸化還元過程と,様々な生物学的文脈におけるTrxの役割の研究に貴重なツールとなる.
Mito-Naphは,高精度でインビトロおよびインビボの両方の環境でTrxの研究を容易にする.