バクテリアで発現するタンパク質のサイト選択的なN-メチルピリジニウム-4-カルボックスアルデヒド媒介型トランスアミネーションの最適化と拡張

科学分野:

• 化学生物学 化学生物学とは
• プロテイン工学は,タンパク質の
• バイオコンジュゲーション 化学 化学

背景:

• 部位選択的生物結合は,機能群をタンパク質に化学的に結合させ,タンパク質の機能を研究し,タンパク質ベースの材料の開発を可能にします.
• 以前の研究で,N-末端トランスアミネーションのためのN-メチルピリジニウム-4-カルボアルデヒドベンゼンスルフォナート (ラポポート塩,RS) が確立され,修正のための反応性アルデヒドまたはケトンハンドルを作成しました.
• E. coliにおける再結合タンパク質発現は,しばしば,グルタミン酸末端タンパク質のRS媒介型トランスアミネーションを阻害するN末端メチオニンを産生する.

研究 の 目的:

• E. coliで発現する再結合タンパク質のN端末改変における課題を克服するための戦略を開発する.
• 強化された機能のために,望ましいN端末配列を持つタンパク質のサイト選択的生物結合を可能にします.
• モデル酵素における修正されたおよびネイティブのN端末配列に対するRSトランスアミネーションの適用性を検証する.

主な方法:

• N端のグルタミン酸残基を生成するために,XA因子タンパク質分解割裂部位を挿入する.
• タンパク質の発現と特徴付け,代替的な高生産性のN端末配列を持つ.
• モデルセルラーゼ酵素 (Pyrococcus horikoshiiからのエンドグルカナーゼ) のサイト誘導性変異.
• RSトランスアミネーションに続いてアルコキシアミン反応剤による改変.

主要な成果:

• N端のグルタミン酸残留物の生成は,因子XAの割れによって成功し,RSのトランスアミネーションを容易にする.
• 直接RSトランスアミネーションに適合する代替のN端末配列の特定.
• RSトランスアミネーションとその後のアルコキシアミン改変が,モデル酵素のセルロース分解活性を阻害しないことを示す.
• 熱性エンドグルカナーゼに対するこれらの戦略の検証.

結論:

• 開発された方法は,E. coliにおけるRS媒介タンパク質改変のための適切なN端末配列を表現する際の制限を克服しています.
• サイト選択的N端子機能化は,未修正のセルラーゼ活性によって示されるように,タンパク質機能と達成可能であり,互換性があります.
• この研究は,RSトランスアミネーションの有用性を拡張し,多様な用途のための明確に定義されたタンパク質バイオコンジュガートを生成します.