単一の染料を使用した相対測定画像は,Rac1とCdc42の活性化を同時に可視化します
Christopher J MacNevin1, Alexei Toutchkine1, Daniel J Marston1
1Department of Pharmacology, The University of North Carolina at Chapel Hill , Chapel Hill, North Carolina 27599, United States.
Journal of the American Chemical Society
|February 11, 2016
まとめ
研究者はCdc42タンパク質の活性を測定するための新しい比率測定バイオセンサCRIB199を開発しました. このバイオセンサは,新しいメロ199染料を用いて,Cdc42とRac1の活性を同時に観察し,細胞の境界ダイナミクスにおけるそれらの役割を明らかにします.
科学分野:
- 細胞生物学
- 生物化学
- 分子イメージング
背景:
- 生体内タンパク質の活性を報告するバイオセンサは,細胞のプロセスを理解するために不可欠です.
- 環境に敏感な光染料はしばしば使用されますが,通常は強度の変化を示し,正確な定量測定を制限します.
- 誘発値や放出量の最大値が変化する染料が必要で,これは稀です.
研究 の 目的:
- Cdc42 (重要なシグナル伝達タンパク質) の活性を in vivo で測定するための新しい比率測定バイオセンサを開発する.
- メロ199を導入する 環境感知用染料で 溶媒に依存する刺激シフトが大きい
- 生体細胞におけるCdc42とRac1の活動を同時にモニタリングできるようにする.
主な方法:
- 溶媒の極性で33 nmの興奮シフトを示す光染料である mero199 の開発.
- メロ199染料を用いたCdc42活性化のための比率的なバイオセンサCRIB199の作成.
- 細胞突起におけるCRIB199 (Cdc42) とFRETセンサー (Rac1) の同時イメージング
- 新しいプログラム エッジプロップを使って タンパク質の活性と 細胞の限界の動態を 関連付けます
主要な成果:
- メロ199染料は,追加の光体なしでCdc42の活性を比率的に検出することができました.
- 同時に観察したところ,細胞の尾の引き戻りではCdc42ではなく,Rac1の活性が低下していたことが明らかになった.
- 特定の突起はCdc42の活性が低下し,EdgePropsの分析はRac1の縮小を示した.
結論:
- メロ199は,細胞内タンパク質活動のための比率的なバイオセンサを作成するための多用途の染料です.
- Cdc42とRac1は細胞突起のダイナミクスにおいて異なる役割を果たし,Rac1は収縮に不可欠である.
- 開発されたバイオセンサと分析ツールは,Rho GTPaseシグナリングをin vivoで研究するための新しい能力を提供しています.
