質量スペクトロメトリーの読み取りを用いたタンパク質-リガンド親和定数の高通量測定のためのホールドアップマルチプレックスアッセイ
François Delalande1, So Ren Østergaard2, Gergo Gogl3
1Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique, CNRS, Université de Strasbourg, IPHC UMR 7178, Infrastructure Nationale de Protéomique ProFI - FR2048, 67087 Strasbourg, France.
Journal of the American Chemical Society
|March 25, 2025
まとめ
Holdup Multiplexアッセイは,質量スペクトロメトリーを使用して,精度でタンパク質-リガンドの親和性を正確に定量化します. この方法は,14-3-3タンパク質の新しい結合部位と,その結合体との相互作用を特定し,プロテオーム全体の相互作用研究を進めました.
科学分野:
- プロテオミクス
- 生物化学
- 分子生物学
背景:
- タンパク質相互作用の正確なモデリングは,タンパク質全体のタンパク質-リガンドの親和性を定量化する必要があります.
- 既存の方法は,大規模のアフィニティプロファイリングのスループットとダイナミックレンジの制限に直面しています.
研究 の 目的:
- タンパク質-リガンドの高通量定量プロファイルのための質量スペクトロメトリーベースの測定法であるHoldup Multiplexを開発し,検証する.
- ヒトの14-3-3タンパク質のリンパペプチドに対する親和性を研究し,リガンド誘発結合部位調節を調査するために,この測定法を使用する.
主な方法:
- マススペクトロメトリー (MS) を利用したホルダップ・マルチプレックス測定法の開発.
- 1000個のフォスフォペプチドに対して7つのヒト14-3-3イソフォームの親和性をプロファイリングする.
- PDZドメインによるX線結晶学と移転性の実証による検証.
主要な成果:
- Holdup Multiplexは,高スループット,ダイナミックレンジ,および感度で,単一の実行で何千もの親和定数を正確に定量化します.
- 14-3-3イソフォームの間で,最も強い結合体として14-3-3γと,最も弱い結合体として14-3-3ε/σとの相乗関係を特定した.
- 何百もの新しい14-3-3結合部位を発見し,Fusicoccin-Aによる数十の部位の調節を特定し,重要な信号伝達経路に影響を与えました.
結論:
- Holdup Multiplexは,プロテオーム全体の定量的な親和性プロファイルのための多用途で強力なツールです.
- この研究は14-3-3タンパク質の相互作用とその調節に関する新しい洞察を提供します.
- この測定は,質量スペクトロメトリで定量化できる様々なタンパク質-リガンド相互作用に適用できる.
