トリプルラベリングは,三色単分子FRETを使用してGPCR中間状態を解決します

科学分野:

• 構造生物学
• 生物化学
• 分子生物物理学

背景:

• ダイナミックなタンパク質複合体の個々の構成変化を相関させるのは,平均化された構造データに依存しているため難しい.
• 単分子フォースター共振エネルギー転送 (smFRET) は,構成動態のモニタリングに有効です.
• smFRETで3つの探査機を使用して同時に距離を測定すると,ドメインの動きが相関できますが,サイト固有のラベリングが必要です.

研究 の 目的:

• 3つの探査機を特定の場所に固定するための直交のトリプルラベリング戦略を開発する.
• タンパク質のラベル付けにおけるネイティブアミノ酸の機能の限界を克服する.
• ダイナミックなタンパク質複合体の高解像度,多距離モニタリングを可能にします.

主な方法:

• 遺伝子コードの拡張とバイオオートゴーナルラベリングを組み合わせた オートゴーナルトリプルラベリング戦略
• 2つの異なる非正規のアミノ酸と酵素による自己標識SNAPタグを使用した.
• ヒトのメタボトロピクグルタミン酸受容体2 (GPCR) に3色センサーを設置した.

主要な成果:

• 本来の機能に干渉することなく,3つの探査機のサイト固有の接続を成功裏に実証しました.
• 多領域Gタンパク質結合神経受容体mGluR2に この方法を適用した.
• 3色smFRETを用いて,mGluR2の以前は特徴づけられなかった構造的中間状態を特定した.

結論:

• 提案された直交三重ラベリング戦略は,複雑なタンパク質の正確なマルチプロンブラベリングに有効です.
• この方法は,先進的なsmFRET研究におけるサイト固有のラベリングにおける重要な課題を克服します.
• この発見は,mGluR2によって示されたGPCRの構成動態に関する新しい洞察を提供します.