ゲオバチルス (Geobacillus) spを用いたイソメラーゼによる高通量スクリーニングプロトコル L-ラムノースイソメラーゼ

科学分野:

• バイオテクノロジー
• 酵素工学
• タンパク質工学

背景:

• 誘導進化は酵素変異を生成しますが,改善された機能性を特定するために効率的な高通量スクリーニング (HTS) が必要です.
• L-ラムノースイソメラーゼ (L-RI) は,D-アルルースをD-アルルースにイソメライズするのに不可欠であり,その活動は色素測定法で検出できる.
• 既存のスクリーニング方法は,大きなミュータントライブラリに必要な効率と精度が欠けている可能性があります.

研究 の 目的:

• 高活性L-ラムノースイソメラーゼ (L-RI) 変種を選択するための堅牢で信頼できる高通量スクリーニング (HTS) プロトコルを作成する.
• D-アルーロースの枯渇に基づくL-RI活性を定量化するための色素測定法を最適化し,検証する.
• タンパク質工学における大規模スクリーニングに適した96wellプレートフォーマットにプロトコルを適応させる.

主な方法:

• シングルチューブ形式で反応条件を最適化して,セリワノフ反応を用いてD-アルルロースの枯渇を正確に測定する.
• 高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) に対して単管試験の検証を精密な定量化のために行う.
• 細胞の採取,上水素の除去,干渉を最小限に抑えるためのフィルタリングを含む96wellプレート形式への測定の適応.

主要な成果:

• 最適化されたプロトコルは,D-アルルロースの減少を正確に定量化し,HPLC測定値と非常に一致しています.
• 96穴のプレート形式は,Z'-ファクター0. 449,シグナルウィンドウ (SW) 5. 288,および測定変数比 (AVR) 0. 551で高い分析品質を示した.
• これらの統計的指標は,高品質のHTS検査の受容基準を満たしています.

結論:

• L-RI活性をスクリーニングするための信頼性の高い効率的なHTSプロトコルが確立されました.
• このプロトコルは,タンパク質工学における高活性イソメラーゼの変種を特定するのに適しています.
• 開発されたHTS方法は,酵素発見と最適化のための産業および研究環境において広く適用可能である.