サイクラゼ領域の冷凍-EM構造と二機能クラスIIテルペン合成における基板チャネリングの評価

科学分野:

• 生化学と分子生物学
• 構造生物学
• 自然製品の生物合成

背景:

• コパリル二酸化合成酵素 (CPS) は,ラブダネ関連天然製品の生合成における重要な酵素であり,薬学的および環境的関連性を有する.
• クラスIIのディターペン合成酵素,特に真菌酵素の構造-機能関係を理解することは,新しい生物活性化合物の探索に不可欠です.
• 双機能CPSは,プレニルトランスファーゼとサイクラゼの両方の活動を有しており,特に基板チャネリングに関して構造的に特徴づけられていない.

研究 の 目的:

• 高解像度冷凍電子顕微鏡 (cryo-EM) で,ペニシリウム・ヴェルキュロスウム (PvCPS) のコパリル二酸化塩酸合成のクラスIIサイクラス領域を決定する.
• PvCPSと既知のバクテリアと植物のオーソログを比較することによって,真菌CPSの構造-機能関係を調査する.
• 双機能PvCPS内のプレニルトランスファーゼとサイクラゼドメイン間の基板チャネリングのメカニズムを解明する.

主な方法:

• PvCPSの63kDクラスIIサイクラースドメインの浄化と冷凍-EM構造的決定 2.9 Åの解像度.
• バクテリアと植物からの同類酵素とのPvCPSの比較構造分析.
• プレニルトランスファーゼとサイクラゼドメインの相互作用と基板移転を評価するための基板競争実験.

主要な成果:

• クリオ-EM構造は,他のCPSと比較して最終的な脱プロトン化段階に含まれる異なる触媒残留物とともに,バイサイクルラブダネコアの形成に不可欠な保存残留物を明らかにします.
• 構造的な比較は,ディターペンの循環の保存されたモチーフだけでなく,真菌酵素のユニークな特徴も強調しています.
• 基質競争試験は,ゲラニルゲラニル二酸化物 (GGPP) のプレニルトランスフェラーゼからサイクラゼ領域への優遇的移転を,独立した構造でも示し,効率的な基質チャネリングをサポートします.

結論:

• PvCPSサイクラゼドメインの構造的および機能的特徴は,真菌II級ディターペン合成の進化とメカニズムに関する洞察を提供します.
• この発見は,プレニルトランスフェラーゼとサイクラゼドメインの間の一時的な結合が基板チャネリングを促進し,コパリル二酸化物の生成を最適化するモデルを示唆している.
• この研究は,潜在的に治療的な応用を持つ新しいラボダネ・スキャフォルドを生成するためのタンパク質工学の取り組みの基礎を築きます.