単一分子直接計数とデジタルPCRによる線形化プラズミドDNA認証基準材料の開発と実験室間検証

科学分野:

• バイオテクノロジー
• メトロロジー
• 分子生物学

背景:

• デジタルPCR (dPCR) は,遺伝子変異とコピー数変異の定量化に不可欠です.
• dPCR カリブレーションのためのSI追跡可能な値の確立は,認証された基準材料 (CRM) の制限により困難です.
• CRMの欠如は,dPCRの結果の比較性を妨げています.

研究 の 目的:

• dPCRのための線形化プラズミドDNA参照材料 (RM) の開発と特徴づけ
• dPCR カリブレーションのためのSI追跡可能な複製数濃度値を設定する.
• 開発したRMを用いてdPCRの結果の比較性を評価する.

主な方法:

• 線形化プラズミドDNA参照材料 (RM) の開発
• 3つの国家測定機関 (NMI) を含む実験室間比較による特徴付け.
• dPCR独立の単一分子カウントとdPCRを用いた正方形の定量化.
• 均質性と安定性の評価
• 重力測定による二次CRM生成
• 二次CRMを用いた4つのdPCRプラットフォームの評価

主要な成果:

• 開発されたRMは同質性と安定性を示した.
• 実験室間の比較では,NMI (En < 1) の間で強い一致を示した.
• 結果の同等性は,拡張された不確実性の中で確立されました.
• 二次的なCRM評価では,dPCRプラットフォームの間では最大10.5%の不一致が明らかになった.
• 核酸の定量化における過大評価の可能性が特定された.

結論:

• 開発された基準材料は,dPCR カリブレーションのためのSI追跡可能な値を提供します.
• CRMはdPCRの定量化を検証し,プラットフォーム間の比較性を確保するために不可欠です.
• 標準化されたCRMは,dPCRシステムにおける核酸定量化における不一致に対処するために必要である.