Cas9編集とトランスクリプトームの共同単細胞プロファイリングは,標的外イベントと遺伝子発現に対する広範な影響を明らかにします

科学分野:

• ゲノミクスと分子生物学
• 遺伝子編集技術
• 単細胞分析

背景:

• CRISPR-Cas9のゲノム工学は,単細胞解像度での編集結果と機能的影響を測定する上で課題に直面しています.
• CRISPR-Cas9のアプリケーションを進めるには,オン・オブ・ターゲットの編集の正確な評価が不可欠です.

研究 の 目的:

• 単細胞解像度でCas9のオン・オフ・ターゲットの編集とその遺伝子発現効果を共同で測定するための新しい技術であるSuperb-seqを導入する.
• 大規模な細胞実験で,Cas9のオフターゲットの編集の流行と影響を特徴づける.

主な方法:

• Superb-seqはT7の局所転写と単細胞RNA配列を解析する.
• 4つのクロマチンリモデレータ遺伝子と7つのガイドRNAを標的とした10,000個のK562細胞に適用された.
• Cas9の編集と下流の遺伝子発現の変化を共同で測定します.

主要な成果:

• Superb-seqは6,230の細胞で11,891の編集イベントを特定しました.
• 7つの高精度ガイドのうち6つは検出可能なオフターゲット編集を誘導しました.
• USP9Xの単一の非ターゲット編集は,広範な下流遺伝子発現の障害を引き起こしました.

結論:

• Cas9のオフターゲティングは広範囲に広がり,イントロン内で頻繁に発生し,遺伝子発現に広範な影響を及ぼします.
• Superb-seqは汎用的でアクセシブルな技術で ゲノム全体のCRISPRスクリーンと 遺伝子編集ガイドの機能的特徴づけを可能にします
• この技術は,CRISPR-Cas9の編集結果と機能的な結果の評価における以前の制限を克服しています.