サイト固有のアセチル化リコンビネントヒストンH3プロテオフォームを用いたトップダウン電気スプレーイオン化-質量スペクトロメトリーにおけるタンパク質イオン相対比率の定量化

科学分野:

• プロテオミクス
• マススペクトロメトリー
• 生物化学

背景:

• 電子スプレーイオン化 (ESI) -質量スペクトロメトリ (MS) は,翻訳後に改変されたタンパク質を分析するために重要である.
• 完ぺきなタンパク質の上から下への分析は,高度なMS技術によってますます実現可能になっています.
• プロテオフォームの正確な定量化には,検知効率に対する翻訳後の改変 (PTM) の影響も考慮する必要があります.

研究 の 目的:

• タンパク質イオン相対比率 (PIRR) の信頼性を検証するために,上から下へとESI-MSでPTMの度合いが異なるプロテオフォームを定量化します.
• ヒストンH3プロテオフォームの異なるアセチル化レベルと部位におけるPIRR定量的正確性を評価する.

主な方法:

• 制御されたアセチル化度で,サイト特異的にアセチル化された再結合ヒストンH3プロテオフォームを生成するために,正交変換システムを利用した.
• UVスペクトロフォトメトリを用いて絶対定量化を行った.
• 直接注入-ESI-MSと弱いカチオン交換/水性相互作用-ESI-MSによるプロテオフォームの同位混合物を分析した.

主要な成果:

• タンパク質イオン相対比率 (PIRR) は,テストされたすべてのヒストンH3タンパク質の理論比率に一貫して一致しました.
• 観察された精度は,アセチル化程度または特定の部位とは無関係であった.
• これは,異質なPTMを持つプロテオフォームのPIRR定量化の信頼性を確認しています.

結論:

• PIRRの定量化は,特に異なるPTMを持つタンパク質の上から下へのESI-MS分析のための有効で信頼できる方法である.
• この発見は,ヒストンのタンパク質の正確な定量化のためのPIRRの使用を支持する.
• この研究は,詳細なプロテオフォームの特徴化のための上から下の質量スペクトロメトリの有用性を強化しています.