in extractoクライオ-EMは、60Sおよび80S粒子上の主要な休眠因子としてeEF2を明らかにする

科学分野:

• 構造生物学
• 分子細胞生物学
• 生物物理学

背景:

• クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）は、高分子構造決定を進歩させた。
• 従来の単粒子クライオ-EMは、精製されたサンプルを必要とし、細胞の文脈を欠く。
• in situクライオ-EMおよびクライオ電子線トモグラフィー（cryo-ET）は、高解像度のサンプル調製とデータ取得に課題を抱えている。

研究 の 目的:

• 高解像度構造研究のための細胞ライセートのクライオ電子顕微鏡（in extractoクライオ-EM）法の導入と検証。
• ほぼネイティブな状態での哺乳類の翻訳装置の組成と構造の調査。
• リボソーム休眠状態と関連タンパク質因子の分析。

主な方法:

• 細胞ライセートのクライオ電子顕微鏡（in extractoクライオ-EM）。
• マップ生成のための高解像度2Dテンプレートマッチング（2DTM）（約2.2 Å分解能）。
• 霊長類細胞株（MCF-7、BSC-1）およびウサギ網状赤血球ライセートにおけるリボソーム集団の分析。

主要な成果:

• in extractoクライオ-EMを用いた哺乳類の翻訳装置のほぼ原子分解能マップの達成。
• 伸長リボソームの存在量の定量（約10％–70％）は、翻訳ストレスを示唆。
• 非翻訳（休眠）リボソームに関連する多数のタンパク質、伸長因子2（eEF2）、LARP1、eIF5Aの同定。
• 伸長因子2（eEF2）は、休眠リボソームの95％以上に結合しており、予期せず60Sサブユニットにも結合し、特定の相互作用によって安定化されていることが判明。
• 開始、伸長、終結因子を含む多様な休眠シナリオの特性評価。

結論:

• in extractoクライオ-EMは、クライオ-EMの柔軟性と細胞環境の複雑性を組み合わせた強力なアプローチを提供する。
• この方法により、ネイティブな細胞複合体とメカニズムをほぼ原子分解能で発見できる。
• 本研究は、リボソーム休眠と翻訳調節に関する詳細な洞察を明らかにする。