CRISPR-Cas6タンパク質-RNA複合体アセンブリを介したリコピン合成酵素アセンブリ制御法の構築

科学分野:

• 代謝工学
• 合成生物学
• バイオテクノロジー

背景:

• 有用化合物の効率的な微生物生産には、代謝経路の最適化が不可欠である。
• CRISPR-Casシステムは、遺伝子操作と経路制御のためのプログラム可能なツールを提供する。
• 酵素の共局在化は、基質チャネリングを介して代謝フラックスを増強することができる。

研究 の 目的:

• 大腸菌におけるリコピン合成酵素をアセンブルするためのCRISPR-Cas6を介した戦略を開発する。
• タンパク質-RNA複合体アセンブリを用いてリコピン生合成効率と生産収量を向上させる。
• タンパク質-RNA足場アセンブリの効果を従来の विध法と比較する。

主な方法:

• 大腸菌におけるリコピン生合成のために16個のプラスミド（LYC-1からLYC-16）を設計した。
• タンパク質-RNA複合体形成のためにCRISPR-Cas6タンパク質（EcCas6eおよびCsy4）とRNA足場を利用した。
• 遺伝子配列、リンカー長、RNA足場発現を体系的に最適化した。
• 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてリコピン生産を定量化した。

主要な成果:

• EcCas6e-Csy4タンパク質-RNA複合体を利用した組換え株LYC-3-4は、最高のリコピン収量（4.02 mg/L）を達成した。この収量は、RNA配列が不一致の対照株と比較して58%、酵素を個別に発現させた場合と比較して41%高かった。タンパク質-RNAによる空間的共局在化は、基質チャネリング効率を大幅に向上させた。

結論:

• RNA足場を用いたCRISPR-Cas6タンパク質アセンブリは、代謝経路における効率的な酵素共局在化を可能にする。
• このタンパク質-RNAを介した戦略は、大腸菌におけるリコピン生産を大幅に向上させる。
• このアプローチは、代謝工学および有用な代謝産物の微生物生産のための柔軟でスケーラブルなツールを提供する。