ヒト由来翻訳システムにおけるeIF2αブレーキの克服

科学分野:

• 分子生物学
• 細胞生物学
• 合成生物学

背景:

• ヒト由来無細胞翻訳システムは、遺伝子発現の研究および合成生物学ツールの開発に不可欠である。
• これらのシステムにおける生産性は、しばしば真核生物開始因子2α（eIF2α）のSer52残基における阻害性リン酸化によって制限される。

研究 の 目的:

• 編集可能なヒト細胞型および編集が困難なヒト細胞型におけるeIF2αリン酸化媒介開始ブロックを回避するための戦略を体系的に探求および比較する。
• 高活性ヒト無細胞翻訳抽出物を生成するための最適な方法を特定する。

主な方法:

• Expi293F細胞におけるeIF2α-S52A変異体を作成するためのEIF2S1のゲノム編集。
• Expi293F細胞におけるEIF2AK2（PKR）の遺伝的ノックアウト。
• iPSCおよび初代線維芽細胞におけるテトラサイクリン誘導制御下でのGADD34（PPP1R15A）およびK3Lの安定的なpiggyBac導入。
• 抽出物生産のための心筋細胞への操作iPSCの分化。

主要な成果:

• ゲノム編集によるExpi293F細胞でのeIF2α Ser52リン酸化（eIF2α-S52A）のブロックは、翻訳抽出物の活性を著しく増加させた。
• EIF2AK2（PKR）のノックアウトもExpi293Fライセートでの翻訳を強化し、eIF2αリン酸化が主要なボトルネックであることを確認した。
• iPSC（心筋細胞を含む）および初代線維芽細胞へのpiggyBacシステムを介したGADD34およびK3Lの発現は、翻訳出力を首尾よく改善した。
• これらの発現ベースの方法は、ゲノム編集が実現不可能なシステムのための実行可能な代替手段を提供する。

結論:

• eIF2αリン酸化は、ヒト無細胞抽出物における堅牢な翻訳の主要な障壁である。
• eIF2αまたはPKRノックアウトのゲノム編集は、編集可能な細胞システムに最適である。
• ポータブルなGADD34/K3L発現カセットは、挑戦的または編集不可能なシステムからの翻訳活性ライセートの生産を可能にし、ヒト無細胞翻訳の有用性を広げる。