PAM緩和型黄色ブドウ球菌Cas9の完全計算設計とターゲティング能力の拡大

科学分野:

• 遺伝学およびゲノミクス
• タンパク質工学
• バイオインフォマティクス

背景:

• CRISPR-Cas9遺伝子編集は強力ですが、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）認識によって制限されます。
• 黄色ブドウ球菌Cas9（SaCas9）はinvivoデリバリーに適していますが、制限的なNNGRRT PAMを持っています。

研究 の 目的:

• 計算設計を用いてPAM特異性が緩和されたSaCas9変異体を開発すること。
• 設計された変異体のゲノムおよび塩基編集効率を評価すること。

主な方法:

• UniDesign、計算タンパク質設計ワークフローを利用してSaCas9変異体を生成しました。
• 点突然変異（E782K/N968R/R1015H）を導入してKRH変異体を生成しました。
• 複数のヒト細胞型で編集効率を評価しました。

主要な成果:

• KRH変異体は、拡張されたNNNRRT PAMを効率的に認識します。
• KRHは、KKH変異体と同等のゲノム編集および塩基編集効率を示しました。
• 構造解析により、KRHがPAM特異性を緩和するために相互作用を微調整していることが明らかになりました。

結論:

• 計算設計は、PAM特異性が変化したCas9変異体を効果的にエンジニアリングできます。
• KRH変異体は、ゲノム編集アプリケーションを拡大するための貴重なツールを提供します。
• このアプローチは、新しいCas9ヌクレアーゼを開発するためのスケーラブルな戦略を提供します。