シトクロムP450 BM3における非天然芳香族水酸化の予測因子としてのインジゴ形成

科学分野:

• 生体触媒および酵素工学
• 合成生物学
• タンパク質進化

背景:

• シトクロムP450 BM3は、水酸化およびエポキシ化のための多用途酵素です。
• 指向性進化により、合成用途での反応性が拡大しました。
• P450 BM3における新規基質特異性のスクリーニングは困難です。

研究 の 目的:

• インジゴ形成を、非天然芳香族化合物のP450 BM3水酸化の予測マーカーとして確立すること。
• 触媒活性と基質広容性が強化されたP450 BM3変異体の発見を加速すること。
• 生体工学用途のためのP450 BM3の基質範囲を拡大すること。

主な方法:

• P450 BM3の42個の活性部位位置に対する部位飽和変異誘発。
• 形質転換した大腸菌コロニーにおけるインジゴ生産のスクリーニング。
• 17個の芳香族化合物の水酸化を定量するための比色アッセイ（4-アミノアンチピリン）。
• 変異体の特性を分析するための分子動力学（MD）シミュレーション。

主要な成果:

• 142個の新しいインジゴ産生P450 BM3変異体を特定しました。
• 10個の非天然芳香族化合物が、多くの変異体によって効率的に水酸化されました。
• インジゴ陽性変異体は、インジゴ陰性変異体と比較して、有意に高い平均活性と基質広容性を示しました。
• 活性と広容性におけるトップパフォーマー変異体はすべてインジゴ陽性であり、野生型と比較して最大167倍高い活性を示しました。

結論:

• インジゴ形成スクリーニングは、活性と広容性が強化されたP450 BM3変異体を特定するための、信頼性が高く効率的な一次ツールです。
• この方法は、非天然基質に対するP450 BM3の機能レパートリの拡大を加速します。
• 機械可読データ形式は、基質-変異体相互作用を予測するための将来の計算および機械学習アプローチをサポートします。