スピンニングディスク共焦点顕微鏡と光子再割り当てによる全細胞超解像イメージング

科学分野:

• 細胞および分子イメージング
• 生物物理学
• 顕微鏡技術

背景:

• 単一分子局在化顕微鏡法（SMLM）はナノスケール解像度を提供しますが、通常は細胞の表面近くのイメージングに限定されます。
• TIRFやHILOなどの従来の照明方法は、SMLMをカバーガラスに近い領域に制限します。
• 細胞全体を3次元でイメージングできるSMLM技術の必要性が存在します。

研究 の 目的:

• 光子再割り当て（SDC-OPR）を備えたスピンニングディスク共焦点顕微鏡を使用して全細胞SMLMを実行するためのプロトコルを提示すること。
• DNAポイント蓄積によるナノスケールトポグラフィー（DNA-PAINT）イメージングとDNA標識プローブを使用して、細胞全体の体積全体にわたって高精度の単一分子イメージングを可能にすること。
• カスタム光学機器なしで標準的な共焦点機器を使用した深部SMLMのためのアクセス可能な方法を提供すること。

主な方法:

• 光子再割り当て（SDC-OPR）を備えたスピンニングディスク共焦点顕微鏡を利用しました。
• 細胞内ラベリングのためのDNA標識プローブを使用したDNAポイント蓄積によるナノスケールトポグラフィー（DNA-PAINT）を採用しました。
• 顕微鏡構成、深部イメージングのための取得パラメータ最適化、および多色イメージングのためのサンプル準備に関する段階的なガイダンスを開発しました。

主要な成果:

• SDC-OPRとDNA-PAINTを用いた全細胞SMLMを標準的な共焦点顕微鏡で実証しました。
• 細胞全体の体積全体にわたって高精度の単一分子イメージングを達成しました。
• 細胞深部領域における背景の最小化、解像度の最適化、イメージング品質の確保のための重要な考慮事項を提供しました。

結論:

• このプロトコルにより、容易に入手可能な共焦点顕微鏡機器を使用した深部、全細胞SMLMが可能になります。
• SDC-OPR法は、膜近傍領域を超えたSMLMで対処可能な生物学的問題の範囲を大幅に拡大します。
• 研究者は、高精度で細胞体積全体のナノスケール構造を探求できるようになりました。