真核生物由来酵素の指向性進化のためのin situ折り畳み技術の開発

科学分野:

• 生化学
• 分子生物学
• タンパク質工学

背景:

• 真核生物由来酵素は、E. coliにおいて不活性な封入体として発現されることが多く、指向性進化を妨げる。
• 折り畳みとスクリーニングの従来の Скрининг方法は、大規模ライブラリには非効率的である。

研究 の 目的:

• 封入体として発現する真核生物由来酵素の指向性進化のためのハイスループットスクリーニング戦略を開発する。
• in situ折り畳みによる機能的酵素変異体の迅速な同定を可能にする。

主な方法:

• マイクロプレート培養、誘導、細胞溶解、in situ変性、折り畳みを含む、合理化されたワークフローを確立した。
• ヒトDNase I触媒ドメインの変異導入をガイドするためにバイオインフォマティック分析を利用し、1,051個の変異体からなるライブラリを作成した。
• 不溶性タンパク質発現から直接スクリーニングプロセスを実装した。

主要な成果:

• 酵素活性が4.1倍向上したヒトDNase I変異体（N78T、V90N）を同定した。
• 同じ戦略を用いてベンゾナーゼ変異体で40%の活性向上を達成した。
• in situ折り畳みアプローチの一般性と効率を実証した。

結論:

• in situ折り畳みは、封入体として産生される真核生物由来酵素の指向性進化のための効果的な戦略である。
• この方法は、困難な酵素ターゲットの機能的変異体の同定の効率を大幅に向上させる。
• 開発されたワークフローは、タンパク質工学と酵素最適化を加速する。