小型Cas12システムの発見と特性評価のためのプロトコル

科学分野:

• 分子生物学
• ゲノム編集技術
• バイオインフォマティクス

背景:

• アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを介したCRISPRヌクレアーゼの効率的な送達は、ヌクレアーゼのサイズによって制限される。
• このサイズ制限は、単一のAAVベクター内での調節要素および追加の治療用ペイロードのためのスペースを制限する。
• 小型Cas12ヌクレアーゼは、RNA誘導DNA切断活性を維持しながら、パッケージングの制約を軽減することにより解決策を提供する。

研究 の 目的:

• 機能的でコンパクトなCas12ヌクレアーゼを特定するためのワークフローを開発および検証する。
• 治療ゲノム編集のためのAAVベクターにおけるパッケージング容量の制限という課題に対処する。
• 送達制限のある設定のための新規Cas12ヌクレアーゼの工学の基礎を提供する。

主な方法:

• 大規模な配列マイニングと系統発生および構造フィルタリング。
• プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）プロファイリングとinvitro DNA切断アッセイ。
• ヌクレアーゼ活性を確認するための細菌ゲノム干渉およびヒト細胞におけるゲノム編集アッセイ。

主要な成果:

• 機能的でコンパクトなCas12バリアントのセットに広範な配列データを蒸留した。
• 細菌およびヒト細胞アッセイでの活性の実証は、これらのヌクレアーゼの可能性を確認する。

結論:

• 開発されたワークフローは、AAV送達に適した小型Cas12ヌクレアーゼを効果的に特定する。
• これらのコンパクトなヌクレアーゼは、パッケージングの制限を緩和し、invivoゲノム編集アプリケーションの可能性を高める。
• 特定されたCas12バリアントは、遺伝子治療におけるさらなる工学のための貴重な出発点として機能する。