ウェット-ドライ-ウェット実験によるアプタマー単離と重要結合ドメインの同時の同定

科学分野:

• バイオテクノロジー
• 分子生物学
• 化学生物学

背景:

• アプタマーの重要結合ドメイン（CBD）の同定には、通常、広範な親和性スクリーニングが必要です。
• 現在のアプタマー単離およびCBD同定方法は、しばしば時間と労力がかかるものです。

研究 の 目的:

• アプタマーとそのCBDの同時単離のための効率的なウェット-ドライ-ウェット実験戦略を開発および検証すること。
• この方法をラパマイシン結合アプタマーの単離とCBDの特性評価に適用すること。

主な方法:

• 初期ライブラリ濃縮のために、15サイクルのCapture-SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）を実施しました。
• K-merアセンブリ、RBM（Restricted Boltzmann Machine）、mFoldシミュレーションを含むハイスループットシーケンシングデータ解析により、主要なアプタマー構造モチーフ（3S3Lおよび3S3L-A）が同定されました。
• 構造的に制限されたライブラリに対して6サイクルの2回目のCapture-SELEXを実施し、その後シーケンシングにより高親和性アプタマーとそのCBDを同定しました。

主要な成果:

• 本研究では、ナノモル濃度の解離定数と高い特異性を持つラパマイシン結合アプタマーを分離することに成功しました。
• 11ヌクレオチドのCBDが同定され、このドメイン内の変異により結合におけるその重要な役割が確認されました。
• ストランド置換蛍光センサーが開発され、ヒト血清中のラパマイシンに対してナノモル検出限界を達成しました。

結論:

• 開発されたウェット-ドライ-ウェット戦略は、アプタマー単離とCBD同定のための効率的かつ同時的なアプローチを提供します。
• この方法は、多数の配列に対する煩雑な親和性試験の必要性を大幅に減らします。
• このアプローチは、さまざまな分子標的のためのアプタマーの発見と特性評価に適用可能です。