機能的なCas9タンパク質の効率的な浄化のための1段階の方法
Xinzhi Duan1,2, Zhengrong Zhou2, Aihua Mao1,2
1Biology Department, College of Sciences, Shantou University, Shantou, China.
私たちは,E. coliのユビキチン融合システムを用いて,簡素化された1段階のCRISPR/Cas9浄化方法を開発しました. このアプローチにより,ゲノム編集アプリケーション用の高純度,機能的なCas9タンパク質が得られます.
科学分野:
- 分子生物学は分子生物学である.
- バイオテクノロジー バイオテクノロジー
- 遺伝学 遺伝学とは
背景:
- CRISPR/Cas9は,ゲノム編集に不可欠である.
- Cas9リボヌクレオプロテイン (RNP) 複合体は,オフターゲット効果の減少などの利点を提供します.
- 現在のCas9浄化方法は複雑で,時間がかかり,収穫量を減らす.
研究 の 目的:
- 機能性Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) の単純化され,高生産性の浄化戦略を開発する.
- 効率的なSpCas9生産のために,Escherichia coliでユビキチン (Ub) 融合システムを活用する.
- ゲノム編集アプリケーションの活性Cas9の直接浄化を可能にします.
主な方法:
- E. coliにおけるHis-Ub-Cas9に対するN端のユビキチン融合戦略を採用した.
- ニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィーを用いて単段階の浄化を行い,プロテアゼ分裂を排除した.
- 精製されたHis-Ub-Cas9の活性をゼブラフィッシュの胚で検証した.
主要な成果:
- >95%の純粋なHis-Ub-Cas9融合タンパク質の高収量生産 (>8 mg/L) を達成しました.
- Ubタグは,浄化のためにタンパク質分解の除去を必要としないことを実証しました.
- 精製されたタンパク質の堅固なDNA分裂活動とゲノム編集効率がin vivoで確認されました.
結論:
- ユビキチン融合システムは,機能的なSpCas9.9を生産するための簡素化された1段階の方法を提供します.
- この簡素化されたプロトコルは,ゲノム編集におけるCas9タンパク質の広範な応用を容易にする.
- この方法により,タンパク質の溶解性と産出量が向上し,RNP複合体の形成のためにCas9が容易に利用可能になります.
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