エンジニアリングされたFAD依存性酸化還元酶のスクリーニングのための急速な活動ベースの色素測定CoFiブラット

科学分野:

• バイオケミストリー バイオケミストリー
• 分子生物学は分子生物学である.
• プロテイン工学は,タンパク質の

背景:

• タンパク質変種ライブラリの高通量スクリーニングは,バイオテクノロジーの進歩に不可欠です.
• 酵素活性に関する機能的検証は,タンパク質工学のワークフローにおけるボトルネックであり続けている.
• 既存の方法は,しばしば効率が欠けているか,または酵素性能を直接測定できない.

研究 の 目的:

• 酵素活性と溶解性を評価するための迅速でタグのない方法を開発する.
• 計算によるタンパク質設計と実験的な機能的検証の間のギャップを埋めるために.
• エンジニアリングされた酵素ライブラリをスクリーニングするための費用対効果の高いツールを提供すること.

主な方法:

• カロリメトリックコロニーフィルタレーション (CoFi) ブラットアッセイを開発しました.
• 2,6-ジクロロフェノリンドフェノール (DCIP) ベースのリドックス結合反応を可視化のために利用しました.
• この方法をE. coliコロニーのFAD依存性グルコース脱水素酶 (FAD-GDH) に適用した.
• 酵素溶解性と触媒活性が同時に評価された.

主要な成果:

• CoFi blotは,酵素のターンオーバーを数分で膜に直接可視化します.
• エンジニアリングライブラリから高活性なFAD-GDH変種を成功裏に特定しました.
• リード型は,ワイルド型と比較して,脱色化ハロー領域の16倍の増加を示した.
• 溶解性と活性性の同時評価が実証されています.

結論:

• CoFi blotは,酵素の機能的検証のための超高速,タグフリー,および活動ベースの方法です.
• このアプローチは,タンパク質変異のスクリーニングを大幅に加速します.
• このプラットフォームは,DCIPを減少させる幅広い酸化還元酶に適用できます.