CRISPR関連トランスポゾンを用いたプログラム可能なウイルスベクター工学およびプライム編集

科学分野:

• 分子生物学
• 遺伝子編集
• ウイルス学

背景:

• バキュロウイルスは、組換えタンパク質発現および遺伝子送達に広く使用されています。
• 現在のバクミド工学法は、柔軟性とプログラム可能性が欠けています。
• CRISPR関連トランスポゾンシステムは、高度な遺伝子操作の可能性を提供します。

研究 の 目的:

• 柔軟でプログラム可能なバクミド工学のための最適化されたCRISPR関連トランスポゾンプラットフォームを開発すること。
• 大規模DNA貨物を特定のバクミド遺伝子座に効率的に組み込むことを可能にすること。
• 遺伝子編集のための高度なバキュロウイルスベクター構築のためのプラットフォームの有用性を実証すること。

主な方法:

• RNAガイドバクミド編集のための大腸菌におけるCRISPR関連トランスポゾンシステムであるSHOT 2.0の開発。
• バクミド遺伝子座（v-cath、ODVe56）への大規模DNAペイロード（≥14 kb）の部位特異的組み込み。
• プライムエディター（PE5max）をコードするオールインワンバキュロウイルス（v-cath、ODVe56）の構築と試験。
• HEK293T細胞、誘導多能性幹細胞（iPSC）、および肝がん細胞におけるプライム編集効率の評価。

主要な成果:

• SHOT 2.0は、定義されたバクミド遺伝子座への大規模DNA貨物（≥14 kb）の部位特異的組み込みを可能にします。
• ODVe56遺伝子座への組み込みは、連続的なウイルス継代中のトランスジーン安定性を大幅に向上させます。
• このシステムはBac-to-Bac®ワークフローと互換性があり、二重遺伝子挿入を可能にします。
• ベクター媒介プライム編集は、HEK293T細胞で最大85.6%、iPSCおよび肝がん細胞で37.1%の効率を達成しました。

結論:

• SHOT 2.0は、遺伝子編集のための柔軟なプラットフォームを提供するバキュロウイルス工学ツールボックスを大幅に拡張します。
• このプラットフォームは、遺伝子送達を含む多様な応用のため高度なバキュロウイルスベクターの作成を容易にします。
• iPSCおよびがん細胞を含む、挑戦的な細胞タイプを含む様々な細胞タイプにおける堅牢なプライム編集能力を実証しました。