光激活细胞分类作为一种通用超高通量选方法,用于定向进化甘氨基基转移酶
Guangyu Yang1, Jamie R Rich, Michel Gilbert
1Centre for High-throughput Biology (CHiBi) and Department of Chemistry, University of British Columbia, 2036 Main Mall, Vancouver, British Columbia V6T 1Z1, Canada.
Journal of the American Chemical Society
|July 29, 2010
概括
我们开发了一种改进的超高通量选方法,用于工程甘基转移酶 (GTs). 这种方法迅速识别出一种β-1,3-银酸转移酶变体,其活性高出300倍,基质范围更广.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 酶学 是一种酶学.
- 蛋白质工程是指蛋白质工程.
背景情况:
- 甘氨基转移酶 (GTs) 对于合成复杂的寡糖酶至关重要,但在可用性,稳定性和基质特异性方面存在局限性.
- 提高GT的蛋白质工程努力受到有效的高通量选方法缺乏的阻碍.
研究的目的:
- 改进一种超高通量选方法,用于GTs的定向进化.
- 通过设计β-1,3-银酸转移酶 (CgtB) 来证明该方法的有效性.
主要方法:
- 实施双色光激活细胞分类 (FACS) 查协议,以尽量减少假阳性.
- 使用改进的选方法对超过10^7个突变的库进行β-1,3-galactosyltransferase CgtB的定向进化.
主要成果:
- 与野生类型酶相比,鉴定了一种CgtB变异,具有显著更广泛的基质耐受性和300倍增加的活性.
- 工程变体显示了更高效的合成 G ((M1a) 和 asialo G ((M1) 寡糖,治疗性糖脂的关键组成部分.
结论:
- 这项研究建立了一个强大的方法论,用于指导银河系转移酶的进化.
- 开发的选策略为设计广泛的GT提供了一个强大的方法,推进它们在复杂碳水化合物合成中的应用.
