通过无标签的超分子合酶试验来确定蛋白酶基质选择性和抑制

科学领域:

• 生物化学 生物化学
• 分析化学 分析化学
• 频谱学是一种光谱学方法.

背景情况:

• 蛋白酶活性监测对于理解生物过程和药物开发至关重要.
• 现有的方法通常需要标签或不是实时的.
• 开发新的,敏感的,无标签的试验是必不可少的.

研究的目的:

• 开发一种连续的,实时的,无标签的光光谱学试验,用于监测蛋白酶活性.
• 为了利用库库比特[7]uril (CB7) 和阿克里丁 (AO) 的记者对来检测蛋白酶生成的N-终端氨酸残留物.
• 为了描述金属胺酶热解酶的动力学,特异性和抑制.

主要方法:

• 设计了一种超分子合酶试验,使用CB7选择性地结合由蛋白酶分裂产生的N-终端氨残留物.
• 青素色 (AO) 作为光传递器,在高亲和度切割产品从CB7被取代时发出蛋白质分解信号.
• 该试验监测了基质 (例如,Thr-Gly-Ala-Phe-Met-NH2) 和它们的裂变产物 (例如,Phe-Met-NH2).

主要成果:

• 该试验证明了高灵敏度的热溶解素活性实时监测.
• 精确地确定了酶动力学,序列特异性 (例如,Ser / Gly vs. Ala),立体特异性 (d-Ala vs. l-Ala) 和对终端电荷的敏感性.
• 色胺的抑制常数被确定为 (17.8 ± 0.4) nM,验证了试验的能力.

结论:

• 开发的测定方法提供了一种可靠的,无标签的方法,用于持续监测蛋白酶活性.
• 这种方法可转移到其他内和外酶,产生N端芳香氨基酸产物.
• 该方法有助于详细描述蛋白酶功能的特征和抑制研究.