通过使用Gd3+旋转标记进行EPR距离测量来测试细胞中的蛋白质构成
Andrea Martorana1, Giuliano Bellapadrona, Akiva Feintuch
1Department of Chemical Physics and ‡Department of Materials and Interfaces, Weizmann Institute of Science , Rehovot, Israel 7610001.
Journal of the American Chemical Society
|August 29, 2014
概括
这项研究引入了一种新的方法,用于使用先进的双电子共振 (DEER) 技术测量人体细胞内的蛋白质结构. 这种新方法克服了以前的局限性,使得更准确的细胞内蛋白质构成研究成为可能.
科学领域:
- 生物物理学的生物物理.
- 结构生物学 结构生物学
- 细胞生物物理学 细胞生物物理学
背景情况:
- 在体外蛋白质结构研究与原生细胞环境不同,原因是拥挤,pH值和结合效应.
- 双电子电子共振 (DEER) 与位点定向的自旋标签对于冷溶液中的蛋白质构成分析有价值.
- 细胞内DEER面临的挑战是旋转标签的不稳定性和常规频率的低灵敏性.
研究的目的:
- 为细胞内双电子共振 (DEER) 距离测量开发一种可靠的方法.
- 为了克服标准氧化物旋转标签的局限性,并提高对细胞内蛋白质研究的敏感性.
主要方法:
- 使用抗还原的加多 (Gd3+) 酸盐作为旋转标签,以提高稳定性.
- 使用高频电子磁共振 (EPR) 在94.9 GHz以提高灵敏度.
- 实施低透性冲击,以有效地将标记的蛋白质输入人体细胞.
主要成果:
- 在HeLa细胞中进行细胞内DEER测量的概念证明.
- 在细胞环境中,成功地用双重标记的ubiquitin测量了距离.
- 验证了Gd3+标签和高频EPR在细胞内应用中的有效性.
结论:
- 提出的方法使得可靠的细胞内DEER测量蛋白质结构.
- 这种方法克服了关键的挑战,为研究蛋白质动态在它们的原生细胞环境中铺平了道路.
- 这些发现大大推动了细胞内结构生物学领域的发展.
