一种基于流细胞计的新型检测方法,用于识别HCN4 CNBD体
Magdalena N Wojciechowski1, Sebastian Schreiber1, Joachim Jose1
1University of Münster, Institute of Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, Pharmacampus, 48149 Münster, Germany.
Pharmaceuticals (Basel, Switzerland)
|May 27, 2023
概括
开发了一种新的无蛋白净化试验,使用表面显示的HCN4 C-Linker-CNBD对大肠杆菌进行测试. 这种方法量化了对超极化激活和循环核酸关口 (HCN) 通道的联体结合,有助于药物开发.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 药理学 药理学是指药理学的学科.
背景情况:
- 超极化激活和循环核酸 (HCN) 道与各种疾病有关,这使得它们成为有吸引力的治疗点.
- 开发针对循环核酸结合域 (CNBD) 的选择性化合物对于 HCN 通道特定药物发现至关重要.
- 了解与HCN4 CNBD的配体相互作用是设计有效调节器的关键.
研究的目的:
- 建立一个快速的,无需蛋白质净化,用于HCN通道药物开发的联体结合试验.
- 描述cAMP及其衍生物与HCN4 C-Linker-CNBD的结合动力学.
- 调查已知药物伊瓦布拉丁和 gabapentin 与 HCN4 CNBD 的相互作用.
主要方法:
- 一个表面显示的HCN4 C-Linker-CNBD结构被表达为大肠杆菌.
- 使用流式细胞计和单细胞分析监测了8-Fluo-cAMP的带结合.
- 结合常数 (Kd,Ki) 和竞争性结合模式通过各种分析确定,包括联体枯竭和IC50测量.
主要成果:
- 对于与HCN4-CNBD结合的8-Fluo-cAMP,确定了173 ± 46nM的解离常数 (Kd).
- 循环腺单酸盐 (cAMP) 表现出具有竞争力的结合,其 K i 值为 8.5 ± 2 μM.
- 伊瓦布拉丁对联体结合没有影响,而 gabapentin 与 HCN4-CNBD 没有相互作用,这表明结合部位不同.
结论:
- 开发的试验有效地确定了cAMP衍生物对HCN4-CNBD的结合常数.
- 这种方法有助于识别针对HCN4-CNBD的新型配体.
- 这些发现为 gabapentin 与 HCN4 通道的相互作用提供了新的见解,表明它不会与 CNBD 结合.
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