使用CRISPR-Cas9生成珀抑制细胞系
Birthe Meineke1, Simon J Elsässer2
1Laboratory of Synthetic and Systems Biology, Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Genome Biology, Karolinska Institutet, Solna, Stockholm, Sweden. birthe.meineke@scilifelab.se.
Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)
|June 5, 2023
概括
本研究详细介绍了一种CRISPR-Cas9方法,用于创建稳定的细胞系,有效地将非正规氨基酸 (ncAAs) 纳入蛋白质中. 这种遗传密码扩展技术使哺乳动物细胞的特定位点蛋白质修饰成为可能.
科学领域:
- 生物化学 生物化学
- 分子生物学分子生物学
- 合成生物学 合成生物学
背景情况:
- 遗传密码的扩展使非正规氨基酸 (ncAAs) 的特定位点蛋白质修饰成为可能.
- 甲索萨奇纳 (Methanosarcina mazei) 的pyrrolysine-tRNA/synthetase (Mma PylT/RS) 对促进了ncAAs在哺乳动物细胞中的结合.
- ncAAs允许高级应用程序,如点击化学和照片控制.
研究的目的:
- 开发一种用于生成CRISPR-Cas9敲进细胞系用于遗传密码扩展的通用协议.
- 使用Mma PylT/RS系统建立稳定的哺乳动物细胞系以有效抑制珀.
- 将PylT/RS表达卡塞特集成到AAVS1安全港位中,以实现强大的蛋白质表达.
主要方法:
- 利用CRISPR-Cas9基因编辑诱导双链断裂 (DSB) 来进行非同类末端连接 (NHEJ) 修复.
- 准了PylT/RS表达盒到人类细胞中的AAVS1安全港位.
- 采用模块化珀抑制等离子体系统,用于敲进和随后的短暂转染.
主要成果:
- 成功生成了CRISPR-Cas9敲进细胞系,以稳定地表达Mma PylT/RS.
- 在工程细胞系中证明有效抑制珀.
- 展示了AAVS1安全港位点对于一致的PylT/RS表达的实用性.
结论:
- 开发的CRISPR-Cas9敲门策略提供了一种强大的方法,用于创建稳定的细胞系以扩展遗传密码.
- 这种方法促进了ncAA的特定站点的整合,使先进的蛋白质工程应用成为可能.
- 该协议提供了一个可通用的平台,用于生成用于各种研究目的的转基因哺乳动物细胞.
