在Issatchenkia orientalis中用于多拷贝基因集成的着陆台系统
Zia Fatma1, Shih-I Tan1, Aashutosh Girish Boob1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, United States.
Metabolic engineering
|June 21, 2023
概括
研究人员开发了一个新的基于CRISPR的着陆台系统,用于在酵母Issatchenkia orientalis.中高效的多重基因组工程. 这种工具可以整合多个基因,改善有机酸的生产和推进代谢工程的努力.
科学领域:
- 微生物学 微生物学
- 合成生物学 合成生物学
- 生物技术是生物技术.
背景情况:
- 东方酵母是一种强壮的非传统酵母,能够在酸性条件下生长,因此适合有机酸生产.
- 最近I. orientalis遗传工具的进步,包括CRISPR-Cas9,已经促进了代谢工程,但高效的多副本集成复杂的途径仍然是一个挑战.
研究的目的:
- 开发高效的多副本集成工具,用于在I. orientalis.中进行多重基因组工程.
- 使用CRISPR-Cas9.9创建一个多功能着陆台系统,用于构建使用CRISPR-Cas9.9的大型复杂代谢途径.
主要方法:
- 开发了一个生物信息学管道,以识别和优先考虑基因间基因位点进行基因组编辑.
- 在21个基因间区域特征了47个指导RNA (gRNA),用于切割效率,基因磁带集成,细胞适应性和GFP表达.
- 设计了一个登陆台系统,使多个基因能够使用单个gRNA和多个修复模板集成.
主要成果:
- 使用着陆台系统,证明了 2 到 5 个基因同时集成到目标位置,效率> 80%.
- 通过在一个步骤中整合五个基因副本,成功地改善了5-氨基诺氨酸的生产.
- 通过整合五个基因表达卡塞特,构建了一条酸生产途径,在批量发酵中产生9 g/L.
结论:
- 开发的单个gRNA介导的CRISPR平台和着陆台系统对于在I. orientalis.中建立复杂的代谢途径是有效的.
- 该系统显著提高了多重工程能力,为非传统酵母的代谢工程提供了有价值的工具.
