基于氧气消耗量化定量化活人细胞中化学遗传H2O2的产生
Wytze T F den Toom1, Daan M K van Soest1, Paulien E Polderman1
1Center for Molecular Medicine, University Medical Center Utrecht, Universiteitsweg 100, 3584 CG, Utrecht, the Netherlands.
Free radical biology & medicine
|July 1, 2023
概括
这项研究引入了一种新的测定方法,用于测量d-氨基酸氧化酶 (DAAO) 产生的过氧化 (H2O2). 这种方法有助于研究人员确定H2O2水平是生理性的还是人造的,从而推进了氧化还原生物学研究.
科学领域:
- 转毒生物学 转毒生物学
- 酶学 是一种酶学.
- 细胞信号传输 细胞信号传输
背景情况:
- 过氧化 (H2O2) 作为信号分子和破坏剂,其作用取决于度和定位.
- 以前的研究经常在超生理水平上使用外源的H2O2,无法模仿内源的,低水平的细胞内生产.
- 酶d-氨基酸氧化酶 (DAAO) 产生H2O2,但缺乏直接测试来量化其活性,这阻碍了表型解释.
研究的目的:
- 开发一种简单的试验,直接量化DAAO的H2O2产量.
- 为了能够比较DAAO产生的H2O2水平与生理线粒体反应性氧物种 (ROS) 生产.
- 改进基于DAAO的模型在氧化还原生物学研究中的解释和适用性.
主要方法:
- 通过测量H2O2生产过程中的氧气消耗率 (OCR) 来量化DAAO活性.
- 在同一试验中,将DAAO依赖的OCR与基底线粒体呼吸OCR进行了比较.
- 利用试验来选择表达不同局部DAAO的细胞克隆,以进行亚细胞效应歧视.
主要成果:
- 该试验允许直接量化DAAO活性,并与线粒体呼吸进行比较.
- 在测试细胞中,5毫米的d-Ala导致DAAO依赖的OCR超过基底线粒体呼吸的5%,表明超生理学H2O2水平.
- 该方法有助于选择克隆物来研究局部H2O2效应,将其与总氧化负担区分开来.
结论:
- 开发的试验为准确测量DAAO介导的H2O2产量提供了一个至关重要的工具.
- 这种方法使研究人员能够评估基于DAAO的模型中的H2O2水平是生理的还是超生理的.
- 该试验显著提高了DAAO模型的实用性,促进了对生物系统中ROS的理解.
