一种测定Cas9-sgRNA核蛋白复合体内核酶活性的qPCR方法

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 生物技术是生物技术.
• 基因组编辑 基因组编辑

背景情况:

• 克里斯普尔-Cas是一种领先的基因组编辑技术.
• Cas9-sgRNA核糖蛋白 (RNP) 复合体越来越多地用于基因编辑.
• 量化Cas9 RNP活动对于优化编辑效率至关重要.

研究的目的:

• 开发一种基于定量聚合酶连锁反应 (qPCR) 的测试方法.
• 测量由Cas9 RNP介导的双链断裂 (DSB) 反应.
• 为了比较不同Cas9 RNP的内核酶活动.

主要方法:

• 使用了来自Leuconostoc citreum的向DSR基因和来自Bifidobacterium bifidum的upp基因.
• 通过重组大肠杆菌产生的Cas9蛋白.
• qPCR用于监测Cas9 RNP治疗后的目标DNA度变化.

主要成果:

• 在实验室中优化条件导致Cas9 RNP对dsrDNA进行了特定的裂变.
• qPCR测定成功量化了内核酶活动:28.74单位/μg为365RNP和34.48单位/μg为433RNP.
• 这种方法对不同的基因进行了验证,并且在评估电穿孔对Cas9 RNP活性的影响方面已经证明有用.

结论:

• 一种基于qPCR的新型试验有效量化了Cas9 RNP内核酶活性.
• 该测试为测量基因组编辑效率提供了一个多功能工具.
• 这种方法有助于优化CRISPR-Cas9 RNP的交付和应用.