通过单细胞水凝封装和超高通量选,用于Rhodotorula gracilisd-氨基酸氧化酶的定向进化
Christoph Küng1,2, Rosario Vanella1,2, Michael A Nash1,2
1Institute of Physical Chemistry, Department of Chemistry, University of Basel 4058 Basel Switzerland michael.nash@unibas.ch.
Reaction chemistry & engineering
|July 27, 2023
概括
研究人员使用单细胞水凝封装增强了d-氨基酸氧化酶 (DAAOX),并指导了进化. 这一策略成功地确定了DAAOX变体,改善了潜在的癌症治疗应用的基质结合亲和力.
科学领域:
- 生物催化和酶工程 生物催化和酶工程
- 生物技术和合成生物学
- 蛋白质工程是指蛋白质工程.
背景情况:
- 酶工程对于先进的生物医学和工业用途至关重要.
- 来自Rhodotorula gracilis (RgDAAOX) 的d-氨基酸氧化酶 (DAAOX) 是癌症治疗的候选酶.
- 提高酶性能需要有效的查和进化策略.
研究的目的:
- 开发一个高通量选和定向进化策略,以提高RgDAAOX的性能.
- 为了分离具有更好的催化性能的RgDAAOX变体,特别是较低的迈克利斯常数 (Km).
- 探索工程RgDAAOX在癌症治疗中的潜力.
主要方法:
- 使用单细胞水凝封装用于酵母表面显示RgDAAOX变体.
- 采用与胡卜过氧化酶 (HRP) 的级联反应,在单个酵母细胞周围形成光水凝囊.
- 应用光激活细胞分类 (FACS) 用于在三轮中对大约10^6个克隆进行集体库选,逐渐降低d-Alanine基质度.
- 孤立和特征增强的RgDAAOX变种.
主要成果:
- 通过使用FACS.成功选了一个~10^6 RgDAAOX变体的库.
- 与野生类型酶相比,确定了四种变体,其Km比野生类型酶低5倍以上.
- 在工程变体中观察到基质结合亲和力的明显增加.
- 发现有益突变分布在整个酶结构中.
结论:
- 开发了一种可扩展的水凝封装和基于FACS的选技术,用于酶进化.
- 证明了定向进化的有效性,提高了RgDAAOX的催化效率和基质亲和力.
- 通过合理设计和高通量查的力量来预测全位的挑战.
- 工程RgDAAOX变种显示出在癌症治疗和其他领域的应用的前景.
