在Saccharomyces cerevisiae中高效过度表达和净化多子单元连接复合物
Qiushuang Ji1, Ke Zhang1, Na Cao2
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin, 300072, China.
Protein expression and purification
|August 13, 2023
概括
研究人员开发了一种高效的方法来过度表达和净化HOPS复合体,这对囊泡贩运至关重要. 这种新策略产生了更多的HOPS蛋白,并成功净化了其他多子单元连接复合体 (MTC).
科学领域:
- 细胞生物学 细胞生物学
- 分子生物学分子生物学
- 生物化学 生化学
背景情况:
- 囊泡贩运对于真核细胞的细胞功能至关重要,它依赖于多子单元连接复合体 (MTC).
- 同型融合和蛋白质分类 (HOPS) 综合体是内解体通路中的关键MTC,由于其复杂的结构和低表达水平,很难表达和净化.
研究的目的:
- 开发一种高效的策略来过度表达和净化来自Saccharomyces cerevisiae的HOPS复合物.
- 为了使MTCs进一步进行体外生化和功能研究.
主要方法:
- 使用CRISPR-Cas9 (GTR-CRISPR) 系统,在每个HOPS子单元前集成强大的TEF1促进子,以便过度表达.
- 采用 Staphylococcus aureus 蛋白 A (ProtA) 亲和度净化,然后进行尺寸排除色谱净化.
- 应用负染色电子显微镜来确认HOPS复杂组件.
主要成果:
- 与常用的GAL1促进剂相比,取得了显著更高的HOPS过度表达和净化产量.
- 成功净化HOPS复合体,具有高纯度和同质性.
- 证明了这种方法用于净化其他MTCs的适用性,包括CORVET和GARP复合物.
结论:
- 开发的基于GTR-CRISPR和ProtA的净化策略对于生产纯MTCs非常有效.
- 这种方法有助于未来对MTC进行生化和功能研究.
- 为制备其他具有挑战性的多子单元蛋白质复合体提供了有价值的协议.
