通过使用Lonza 4D-Nucleofector系统,有效地将大型Cas9-EGFP载体输送到猪胎儿纤维细胞中

科学领域:

• 细胞生物学 细胞生物学
• 遗传学 是一个遗传学.
• 生物技术是生物技术.

背景情况:

• 猪胎儿纤维细胞 (PFFs) 对于转基因猪生产至关重要.
• 在PFF中,特别是在大型载体中,传染效率往往不够优.
• 优化PFF中大型载体的传递方法对于在猪中推进基因工程是必不可少的.

研究的目的:

• 使用Lonza 4D-NucleofectorTM系统,优化转化条件,将大尺寸向量传递到PFF中.
• 评估定制的双电穿孔程序和替代电穿孔缓冲器.
• 提高PFFs基因改造的效率.

主要方法:

• 使用Lonza 4D-NucleofectorTM容器和带将13kB的Cas9-EGFP和3.5kB的pMAX-GFP载体输入PFF中.
• 测试了 7 个标准和 6 个定制的双重电解程序.
• 选替代的电穿孔缓冲器,包括Entranster-E.
• 提供针对特定位置的CRISPR/Cas9-sgRNAs,以评估基因组编辑效率.

主要成果:

• 双电穿孔程序,特别是FF-113+CA-137显著超过单电穿孔程序提供13 kb向量 (98.1%在容器,89.1%在条纹).
• 体-E缓冲器显示了与NucleofectorTM P3溶液相比的可比转染效率和细胞活力.
• 与标准程序相比,定制程序实现了优越的基因组编辑效率,Entranster-E缓冲器产生了更高的indel效率.

结论:

• 定制的双电穿孔程序显著提高了使用Lonza 4D-NucleofectorTM系统将大型矢量转化为PFF的传递效率.
• 在PFF电穿孔方面,Entranster-E缓冲器是NucleofectorTM P3缓冲器的可行替代品.
• 优化的方法使猪细胞的基因改造更有效.