相关实验视频

Updated: Jul 18, 2025

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Published on: November 7, 2012

在体内,高通量选择热稳定型环松单氧化酶 (CHMO)

Sarah Maxel¹, Linyue Zhang¹, Edward King²

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Catalysts (Basel, Switzerland)

|August 28, 2023

概括

研究人员使用高通量选平台设计了环松单氧酶 (CHMO),以提高热稳定性. 这种增强的酶变体显示出增加的活性和稳定性,这对于工业应用至关重要.

科学领域:

生物催化和酶工程生物催化和酶工程
蛋白质工程是指蛋白质工程.
工业生物技术工业生物技术

背景情况:

循环松单氧化酶 (CHMO) 具有广泛的基质特异性,可将循环基生物氧化成具有高立体特异性的和乳.
由于CHMO的热稳定性较差,以及蛋白质工程对增强稳定性的挑战,CHMO的工业应用受到限制.
目前用于酶工程的高通量选方法是有限的,阻碍了改善CHMO热弹性的努力.

研究的目的:

开发和应用大肠杆菌中的高通量生长选择平台,以发现CHMO中增强热稳定性的突变.
通过定向进化和理性设计,设计一种更强大,更具工业可行性的CHMO变种.
为了证明一种新的 in vivo 选系统的有效性,用于氧化酶的快速蛋白质工程.

主要方法:

在大肠杆菌 (菌株MX203) 中建立了一个高通量有氧生长选择平台,以选具有更好的热稳定性的CHMO变种.
在高温 (42°C) 条件下生成和选CHMO随机突变性库,使用环素作为基质.
通过通过消耗尼古丁胺胺氨基二核酸盐 (NADPH) 的酶恢复细胞氧化还原平衡,间接测量了酶活性.
用分子建模来理解在已识别的CHMO变体中增强热稳定的结构基础.

主要成果:

一种热稳定的CHMO变种,CHMO GV (A245G-A288V),被确定具有保留的本地活性,在30°C化后,其残留活性增加了约4.4倍.
与野生类型酶相比,CHMO GV在37°C的温度下表现出比野生类型酶高5倍的循环松转化率.
分子建模揭示了CHMO GV中改进的残留包装和额外的骨干结合,有助于其增强的稳定性.
进一步合理的设计导致CHMO A245G-A288V-T415C,它在45°C时显示出更好的热稳定性.

结论:

开发的高通量选平台能够快速发现像CHMO.这样的氧化酶的热稳定性增强突变.
工程化CHMO变种显著提高了热稳定性和活性,解决了工业生物催化剂的关键局限性.
通过CHMO的成功蛋白质工程,证明了通过增强酶强度来扩大生物催化过程的潜力.

关键词:

这种细菌是Acinetobacter sp. 在NCIMB 9871中使用.贝耶尔维利格尔单氧基酶.在NADPH的特异性.循环素单氧化原酶的使用.指导进化是指导进化的.高吞吐率的选择选择.氧化还原平衡的重氧化平衡.热稳定性热稳定性

更多相关视频

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Published on: December 5, 2016

Author Spotlight: Understanding Microbe Adaptation Using Innovative Techniques for Exploring Thermophilic Evolution

Author Spotlight: Understanding Microbe Adaptation Using Innovative Techniques for Exploring Thermophilic Evolution

Published on: June 14, 2024

相关概念视频

In-vitro Mutagenesis

In-vitro Mutagenesis

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

Hyperthermophilic Bacteria

Hyperthermophilic Bacteria

Domain Bacteria includes some unique hyperthermophilic species. They exhibit remarkable adaptations that enable survival in extreme environments.Thermotoga species are rod-shaped, gram-negative, non-sporulating hyperthermophiles that form a sheath-like envelope called a toga. They ferment sugars or starch, producing lactate, acetate, CO₂, and H₂, and can also grow via anaerobic respiration using H₂ and ferric iron. Found in hot springs and hydrothermal vents, over 20% of their...