用于异热放大应用的化学BstDNA聚合酶的增强活性和热稳定性

科学领域:

• 分子生物学分子生物学
• 酶工程是什么? 酶工程是什么?
• 诊断检测试验 诊断检测试验

背景情况:

• 循环介导同热放大 (LAMP) 对于临床诊断,隔离和疾病预防至关重要.
• Bst DNA聚合酶的低催化活性限制了LAMP检测的速度和可靠性.
• 提高Bst DNA聚合酶活性对于开发先进的分子诊断工具至关重要.

研究的目的:

• 为了设计具有更好的催化活性和稳定性的Bst DNA聚合酶突变体.
• 开发一种用于增强实时LAMP性能的化学酶.
• 评估工程酶用于细菌检测的诊断潜力.

主要方法:

• 使用位点导向的突变发生法,根据预测活动位点创建Bst DNA聚合酶变体.
• 一种化学蛋白 (DBD-K431E) 通过融合Pyrococcus abyssi DNA结合酶的DNA结合域来构建.
• 评估了Salmonella typhimurium的酶活性,热稳定性,抑制剂耐受性和诊断敏感性.

主要成果:

• 单个突变K431D和K431E的催化效率分别增加了1.93倍和2.03倍.
• 虚拟机DBD-K431E在高达73°C的温度下显示实时LAMP活动,在70°C的温度下8小时后仍保持活动.
• 与野生型和商业型Bst 2.0.0相比,DBD-K431E对肝素,乙醇和NaCl的耐受性提高,对沙门氏菌Typhimurium的检测能力更强.

结论:

• 其余物K431被确定为Bst DNA聚合酶活性的关键部位.
• 嵌合式DBD-K431E为LAMP应用提供了更好的热稳定性和抑制剂耐受性.
• DBD-K431E是分子生物学研究和敏感的临床诊断,特别是细菌检测的一个有前途的变体.