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Updated: Jul 14, 2025
10:00
A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR
Published on: December 26, 2018
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引导RNA支架变体使大型gRNA集群的简单克隆成为可能,用于多重基因编辑
Yaqi Wang1, Xiaofei Li1, Minglei Liu1
1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.
Plant biotechnology journal
|October 10, 2023
概括
这项研究引入了一种新的方法,用于高效的多重基因编辑,使用工程 Cas9 单导 RNA (sgRNA) 支架和融合聚合酶连锁反应协议. 这种技术可以快速创建针对最多24个位点的基因编辑载体,显著提高基因操纵效率.
科学领域:
- 分子生物学分子生物学
- 生物技术是生物技术.
- 基因组学就是基因组学.
背景情况:
- Cas9蛋白质介导的基因编辑是基因操纵的强大工具.
- 复杂基因编辑,同时针对多个基因,通常是必要的,但由于载体的低效常规克隆方法而受到阻碍.
- 现有的方法与重复的单导 RNA (sgRNA) 支架和结合效率低下作斗争.
研究的目的:
- 开发一种有效的方法来构建多重基因编辑载体.
- 克服传统克隆制造具有多个导向RNA的载体的局限性.
- 为了促进大规模的多重基因编辑应用.
主要方法:
- 使用结构引导和随机突变发生来识别功能性sgRNA支架变体.
- 一个聚合聚合酶连锁反应 (PCR) 协议被开发出来,用于合成多达9个目标的间隔器-脚手架-tRNA-间隔器单元.
- 金门克隆用于基因编辑载体的一步克隆,多达24个目标部位.
主要成果:
- 许多功能性sgRNA支架变体被确定.
- 建立了一个协议,使多重的sgRNA表达单元能够快速合成多达9个目标.
- 多达24个点的基因编辑载体在单个步骤中被高效地克隆.
- 一个针对番茄12个基因的载体导致单一转基因系内的10个基因发生突变.
- 创建了一个Web服务器,以协助设计大型sgRNA表达单元的原始集和模板序列.
结论:
- 开发的方法显著提高了构建多重基因编辑载体的效率.
- 这种方法克服了对大型多重基因编辑的克隆效率的先前限制.
- 创建的网络服务器工具有助于在不同物种中实现多重基因编辑的更广泛应用.
