使用CRISPR/Cas9 RNP通过电转移传递在大豆原生质中确定向突变发生的方法
Saminathan Subburaj1, Sarah Zanon Agapito-Tenfen1
1NORCE Norwegian Research Centre AS, Climate & Environment Department, Siva Innovasjonssenter, Tromsø, Norway.
Frontiers in plant science
|October 16, 2023
概括
电穿孔成功将CRISPR/Cas9核糖蛋白 (RNP) 输入大豆原生质中,为基因编辑提供了无PEG的方法. 这种技术增强了大豆的遗传改进和特征发展.
科学领域:
- 植物生物技术 植物生物技术
- 分子生物学分子生物学
- 农作物科学 农作物科学
背景情况:
- 大豆 (Glycine max L.) 是一种具有重要农业潜力的重要作物.
- 基因编辑,特别是CRISPR/Cas9,为大豆特性改进提供了有希望的途径.
- 聚乙烯糖醇 (PEG) 介导的转染,虽然有效,但可能导致下游工艺中的污染问题.
研究的目的:
- 评估电穿孔作为一种不含聚乙烯糖醇 (PEG) 的方法,用于将CRISPR/Cas9核糖蛋白 (RNP) 复合物输送到大豆原塑体中.
- 优化电穿孔参数,以实现高效的RNP传递,原生质活力和基因编辑.
- 建立一种替代性传递系统,用于在大豆中进行无DNA基因组编辑.
主要方法:
- 由大豆三叶酸叶子衍生的原塑被使用电穿孔系统用CRISPR/Cas9 RNP转染.
- 系统地调查了电穿孔参数,包括电压,脉冲数和持续时间.
- 使用显微镜和针对性深度测序来评估原生质形态,活力和基因编辑效率 (InDel频率).
主要成果:
- 通过在各种电压下持续10毫秒的3个脉冲,实现了最佳的电传输.
- 虽然在测试电压 (5001,300 V) 中保持了原生质完整性,但随着电压的提高,生命力和初始细胞分裂减少.
- 通过GFP标记的Cas9确认了CRISPR/Cas9 RNP传递,CPR5基因的目标插入/删除 (InDel) 频率随着电压的增加而增加,在1300V时达到3.8%8.1%.
结论:
- 电穿孔提供了一种高效和有效的方法,可以将CRISPR/Cas9 RNPs输送到大豆原生质中,从而绕过对PEG的需求.
- 开发的电传染系统有助于在大豆中进行无DNA基因组编辑,支持基因选和特征改进.
- 这种替代的输送方法有可能在大豆和其他相关物种中应用.
